Структура гена фактора VIII (антигемофилический фактор)

Антигемофшшческий фактор (фактор VIII). Гемофилия А — «классическая» наследственная болезнь с Х-сцепленным типом наследования (разд. 3.1.4). Анализ процесса свертывания крови позволил в 50-х гг. идентифицировать белок плазмы-антигемофилический фактор (фактор VIII). Этот белок отсутствует в крови больных гемофилией А. Фактор VIII необходим для первого этапа свертывания крови-образования тромбопластина (см. разд. 4.2.2.9). В настоящее время гемофилию лечат заместительной терапией, вводя концентрат фактора VIII, что позволяет больным гемофилией вести почти нормальный образ жизни. Белковая молекула этого фактора-большая и сложная, и синтезировать ее поэтому очень трудно. Однако в настоящее время появилась надежда получать этот белок с помощью генной инженерии; расшифрована структура фактора VIII, и экспрессию соответствующего гена удалось выявить в культуре ткани [361, 362, 531, 536].

Исследовательская стратегия в изучении гена фактора VIII. Успехи в расшифровке структуры этого гена были достигнуты независимо исследовательскими группами из Сан-Франциско и из Института генетики в Бостоне. Группа из Сан-Франциско действовала следующим образом.

Был синтезирован олигонуклеотидный зонд (длиной в 36 нуклеотидов), соответствующий одному из пептидов, полученных после обработки фактора VIII трипсином. Этот очень короткий ДНК-зонд использовали для скринирования Х,-фаговой библиотеки геномной ДНК человека с кариотипом 49,XXXXY. Следовательно, высокая концентрация Х-специфических фрагментов ДНК была получена не при помощи сортировки хромосом, как описано ранее (разд. 2.3.2.5), а благодаря природной аномалии. Клоны, выявленные с помощью гибридизации с ДНК-зондом (разд. 2.3), имели перекрывающиеся концы, благодаря чему оказалось возможной первичная идентификация какой-то части природного гена (рис. 2.91).

Ее использовали затем для идентифика-

136 2. Хромосомы человека

Рис. 2.91.Анализ гена фактора VIII человека, начинающийся с получения олигонуклеотидного зонда длиной в 36 оснований.

ции и обогащения фракции мРНК фактора VIII с помощью клеточной линии Т-гибридомы. Обогащенная фракция мРНК была нужна для получения кДНК всей кодирующей части гена (9 т. п. н.), которую затем секвенировали (разд. 2.3.2.4). Сравнивая кДНК с геномной ДНК, установили границы экзонов. Оказалось, что полный ген состоит из 186000 пар нуклеотидов. В нем было обнаружено 26 экзонов длиной от 69 до 3 106 п. н., один из интронов имел длину в 32,4 т. п. н. Белок фактора VIII состоит из 2351 аминокислоты (рис. 2.92). Чтобы добиться экспрессии гена в клетках млекопитающих, его кодирующую часть (~7 т. п. н.) «сшили» с частью перекрывающейся ДНК и встроили в плазмиду между промоторами и polyA-последовательностью вирусного происхождения. Полученную рекомбинантную конструкцию с помощью метода кальций-фосфатной преципитации ввели в клетки хомячка. Для выявления экспрессии гена использовали моноклональные антитела к части белка фактора VIII. В опытных клетках по сравнению с контрольными было обнаружено 300-кратное увеличение количества перекрестно-реагирующего материала.

Рис. 2.92. Ген фактора VIII. Открытая полоса: ген, внутри полосы закрашены 26 экзонов. Нижний ряд линий: расположение сайтов узнавания 10 рестрикционных эндонуклеаз, использованных для идентификации. Серые прямоугольники представляют длину ДНК человека, содержащейся в каждом клоне космиды (р) и Д.-фага (По Gitshier et al., Nature 312, p. 327, 1984.)

2. Хромосомы человека 137

Важно отметить, что группа из Института генетики, работавшая в том же направлении, получила аналогичные результаты.

Значение этих исследований. В работах, суть которых мы изложили здесь весьма кратко и упрощенно, для анализа необычно сложного гена авторы изобретательно использовали многие методы молекулярной биологии. Их результаты важны по нескольким причинам.

1. Впервые был проанализирован ген такой длины и сложности у человека (да и вообще у эукариот). Весьма вероятно, что многие другие гены, кодирующие длинные и сложные белки, имеют такую же длину и структуру.

2. Результаты структурного анализа позволяют сделать новые выводы относительно эволюции этого гена [361], учитывая неожиданную гомологию (примерно на 35%) аминокислотной последовательности белка фактора VIII с церулоплазмином (белком, связывающим медь) (см. раздел 7.2.3).

3. Есть основание надеяться, что благодаря генной инженерии лечение гемофилии А станет более безопасным и дешевым. Заместительная терапия препаратами фактора VIII представляет собой один из примеров успешной корректировки наследственного дефекта: продолжительность жизни больных гемофилией резко увеличилась, и многие из них ведут почти нормальный образ жизни. Однако это лечение не свободно от серьезных недостатков. Во-первых, оно очень дорого, поскольку фактор VIII получают из крови человека. Во-вторых, возникает серьезная опасность заразиться гепатитом или вирусом СПИД [314]. В настоящее время, чтобы избежать инфекции, препараты фактора VIII подвергают тщательному вирусологическому скринингу и прогревают. Мы полагаем, что пройдет несколько лет, прежде чем будет получен безопасный, эффективный и клинически испытанный препарат фактора VIII. Впрочем, это может случиться и к моменту выхода в свет нашей книги.

138 2. Хромосомы человека

Экскурс в социологию науки. Анализ гена, о котором шла речь, был проведен двумя очень большими группами, о чем свидетельствует список авторов каждой статьи. Массированное наступление «большой науки» до недавнего времени было более типично для некоторых отраслей физики, например физики высоких энергий. Необходимость такого подхода теперь осознана и молекулярными биологами [428], однако здесь все чаще «батальоны» формируются не университетами или исследовательскими группами, а частными компаниями, поставившими перед собой конечную цель-получить продукт, пользующийся спросом. Должно ли такое развитие стать предметом серьезной озабоченности? Существует ли опасность, что коммерческие интересы слишком сильно будут влиять на развитие науки, отвлекая силы и ресурсы от научно значимых проблем и привлекая их к другим, которые сулят немедленные прибыли? Мы полагаем, что опасность не так велика. Тесные связи между фундаментальными исследованиями и промышленным использованием результатов характерны для техники и для химии. Насколько мы знаем, это не снижает качество фундаментальных исследований в этих областях науки. Для биологов, однако, эта ситуация является новой и потому требует тщательного анализа.