Главная Случайная страница Контакты | Мы поможем в написании вашей работы! | ||
|
Рис. II.38. Комбинаторный синтез олигонуклеотидов, иммобилизованных на твердой подложке
Последовательно предотвращая снятие защитных групп на определенных участках микроматриц (заливка серым цветом) удается соединять четыре нуклеотида во всех возможных комбинациях. В данном примере за 12 (4 х 3) стадий синтеза синтезированы все возможные (34 = 81) тримеры олигонуклеотидов
Для нанесения нуклеиновых кислот на поверхность подложки в основном используют три подхода: короткие олигонуклеотиды синтезируют прямо на ее поверхности, а также прикрепляют к ней предварительно полученные фрагменты ДНК ковалентными или нековалентными связями.
Во время синтеза олигонуклеотидов непосредственно на поверхности стекла применяют те же реагенты и проходят те же стадии, что и при обычном твердофазном синтезе в современных автоматических синтезаторах. В наиболее распространенном варианте при создании микроматрицы используют фотолитографическую маску, которая избирательно закрывает от света и оставляет открытыми участки микроматрицы с синтезируемыми олигонуклеотидами, содержащими чувствительные к облучению светом защитные химические группы. На каждом этапе синтеза маску, которая на схеме обозначена серыми прямоугольниками, помещают над большей частью микроматрицы, а остающиеся открытыми химические группы активируют светом. Затем происходит соединение 5’-гидроксильных групп фосфорамидитных производных добавляемого нуклеотида с активированным сегментом микроматрицы.
Защищая поверхность микроматрицы от света дискретными участками в различных простых комбинациях, удается синтезировать, как это показано на схеме (рис. II.38), за 4·3 = 12 отдельных этапов все теоретически возможные последовательности тринуклеотидов в количестве 34 = 81. В общем случае для синтеза всех возможных последовательностей длиной в N нуклеотидов требуется 4N синтетических стадии. Длина цепи олигонуклеотида, который может быть синтезирован на микроматрице, лимитируется выходом готового продукта на каждой стадии, который составляет ~95%. Так, суммарный выход 25-звенного олигонуклеотида будет составлять всего ~(0,95)25 = 28%. В этой связи рассмотренный метод обычно используют для синтеза олигонуклеотидов, длина которых не превышает 20–25 оснований.
При альтернативном подходе микроматрицы олигонуклеотидов синтезируют на подложке с использованием технологии струйных принтеров. В этом случае головка принтера движется вдоль подложки и, в соответствии с заложенной программой, наносит на необходимые участки небольшие количества раствора с фосфорамидитными производными нуклеотидов из индивидуальных резервуаров. Этапы снятия защитных групп и промывания производятся так же, как и при обычном твердофазном синтезе олигонуклеотидов. Эффективность каждого этапа синтеза в этом случае может превышать 99%, что позволяет синтезировать олигонуклеотиды длиной до 40 оснований с суммарным выходом ~67% (40 этапов с выходом 99% на этап).
Еще одной разновидностью методов создания микроматриц является синтез индивидуальных олигонуклеотидов, их очистка и нанесение с помощью микроробота на поверхность подложки с адгезивным покрытием. Однако создание этим способом микроматриц, содержащих тысячи индивидуальных элементов, – очень трудоемкий процесс.
При конструировании микроматриц, элементы которых содержат индивидуальные кДНК, для нанесения на подложку микропятен чаще всего используют микророботы. В этом случае применяют растворы рекомбинантных кДНК длиной 0,5–1,0 т.п.о., очищенных из бактериальных клеток, которые перед применением как правило, амплифицируют с помощью ПЦР. Поверхность стеклянной подложки покрывают тонким слоем полилизина или обрабатывают аминосиланом с целью создания на ней положительного заряда, что обеспечивает возможность электростатического взаимодействия подложки с отрицательно заряженными молекулами кДНК. Недостатком этого способа является неспецифичность электростатических взаимодействий, в которые вовлечены многие участки кДНК, что уменьшает эффективность взаимодействия кДНК с последовательностями анализируемых образцов. Для преодоления этих затруднений с помощью асимметричной ПЦР синтезируют производные кДНК, которые далее ковалентно соединяют с сиалированным стеклом с помощью боргидрида.
Разрабатываются и альтернативные конфигурации микроматриц, в которых на поверхности стекла фиксируют сами фрагменты ДНК, анализируемой с помощью олигонуклеотидных зондов. Такой подход был использован, в частности для поиска мутаций в гене белка p53. Дальнейшим расширением этого подхода является нанесение на поверхность стекла кусочков тканей с последующим анализом содержащихся в них ДНК или РНК гибридизацией in situ.
Дата публикования: 2014-11-04; Прочитано: 539 | Нарушение авторского права страницы | Мы поможем в написании вашей работы!