Частота ошибок при синтезе ДНК, осуществляемом термостабильными ДНК-полимеразами in vitro при проведении ПЦР в оптимальных условиях

ошибочно спаренных нуклеотидов праймера и ДНК-матрицы одинаково эффективно предотвращают синтез ДНК Taq -полимеразой. По способности направлять синтез ДНК все такие пары 3’-концевого нуклеотида праймера и соответствующего нуклеотида матричной ДНК располагаются в следующий ряд: C–C, A–G, G–A, G–G < A–A < T–C, C–T, T–T << A–C, C–A << G–T, T–G (данные фирмы "Cetus"). При этом наименее благоприятными для продолжения синтеза ДНК являются пары нуклеотидов пурин–пурин и пиримидин–пиримидин.

РНК-зависимые ДНК-полимеразы (обратные транскриптазы, ревертазы). Обратные транскриптазы способны осуществлять синтез ДНК на матрице РНК, полимеризуя четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата, как это имеет место в случае ДНК-зависимых ДНК-полимераз. Обратные транскриптазы, так же как и ДНК-полимеразы функционируют только при наличии затравки. Широко используемая в генной инженерии обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц помимо полимеризующей активности обладает 5’®3’- и 3’®5’-экзорибонуклеазными активностями и расщепляет РНК в ДНК-РНК-гибридах по процессивному механизму. Обратные транскриптазы находят применение в синтезе двухцепочечных ДНК, комплементарных РНК (особенно мРНК), для последующего ее клонирования в плазмидных векторах при получении библиотек (клонотек) кДНК (см. раздел 7.3). Обратные транскриптазы, подобно ДНК-полимеразам, могут быть использованы для введения радиоактивной или флуоресцентной метки в ДНК-зонды в составе соответствующим образом меченных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.

Недавно способность синтезировать ДНК на матрице РНК в определенных условиях была продемонстрирована для термостабильной ДНК-полимеразы Thermus thermophilus. Это позволяет использовать ее для прямого обнаружения специфических РНК в биологических образцах методом ПЦР. Современные модификации такого подхода дают возможность в одной реакционной смеси (и пробирке) синтезировать в реакции обратной транскрипции небольшое число копий амплифицируемого фрагмента ДНК на матрице РНК, которые сразу же используются тем же ферментом в качестве матрицы в обычной ПЦР (one tube PCR).