Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации

ОГЛАВЛЕНИЕ

Предисловие редактора.......................................................................................... 9

Предисловие автора................................................................................................ 12

ЧАСТЬ I. МЕХАНИЗМЫ ХРАНЕНИЯ И РЕАЛИЗАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ.................................................................................... 17

ВВЕДЕНИЕ 18

Глава 1. ГЕНОМ............................................................................................................ 25

1.1. Гены и хромосомы................................................................................... 28

1.2. Геном прокариот....................................................................................... 30

1.2.1. Геном вирусов.............................................................................................. 31

1.2.2. Нуклеоид бактериальной клетки............................................................. 32

1.2.3. Геном архебактерий................................................................................... 34

1.2.4. Минимальный размер генома одноклеточных организмов............. 36

1.3. Геном эукариот.......................................................................................... 39

1.3.1. Последовательности нуклеотидов эукариотического генома......... 40

1.3.2. Хроматин....................................................................................................... 44

1.3.3. Роль ДНК-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина.................................................................................................................. 55

Глава 2. РЕАЛИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ ПРИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ 59

2.1. Транскрипция............................................................................................. 60

2.1.1. ДНК-зависимые РНК-полимеразы.......................................................... 61

2.1.2. Единицы транскрипции (транскриптоны)............................................. 70

2.1.3. Этапы транскрипции.................................................................................. 77

2.1.4. Хроматин во время транскрипции....................................................... 107

2.2. Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации РНК 119

2.2.1. Процессинг РНК у бактерий................................................................... 120

2.2.2. Редактирование пре-мРНК.................................................................... 126

2.2.3. Другие модификации эукариотических мРНК.................................. 136

2.2.4. Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов РНК-полимеразы II........................ 152

2.3. Функциональная компартментализация ядра............................ 156

2.3.1. Интерфазные хромосомы в ядре.......................................................... 157

2.3.2. Ядрышко...................................................................................................... 160

2.3.3. Пространственная организация синтеза мРНК................................ 162

2.3.4. Ядерные тельца и домены..................................................................... 165

2.3.5. Компартментализованное ядро............................................................ 167

2.4. Биосинтез белка рибосомами бактерий........................................ 168

2.4.1. Рибосомы.................................................................................................... 169

2.4.2. Этапы биосинтеза белка......................................................................... 174

2.4.3. Антибиотики, действующие на уровне трансляции........................ 183

2.5. Трансляция у эукариот......................................................................... 185

2.5.1. Особенности первичной структуры эукариотических мРНК......... 186

2.5.2. Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами... 187

2.5.3. Элонгация полипептидных цепей........................................................ 196

2.5.4. Терминация трансляции......................................................................... 198

2.5.5. Трансляция в митохондриях.................................................................. 200

2.5.6. Трансляция в хлоропластах................................................................... 204

Глава 3. ОСНОВНЫЕ ПУТИ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ............ 208

3.1. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот 210

3.1.1. Регуляция на уровне инициации транскрипции.............................. 210

3.1.2. Регуляция синтеза РНК на уровне элонгации и терминации....... 214

3.2. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот 223

3.2.1. Передача сигнала и вторичные мессенджеры................................. 226

3.2.2. Механизмы позитивной регуляции транскрипции.......................... 243

3.2.3. Механизмы негативной регуляции транскрипции........................... 281

3.2.4. Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов 288

3.2.5. Импринтинг................................................................................................. 300

3.2.6. Метилирование ДНК в регуляции транскрипции............................. 301

3.3. Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов............. 312

3.3.1. Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРНК 312

3.3.2. Сплайсинг РНК в регуляции экспрессии генов................................ 325

3.3.3. Избирательная деградация мРНК........................................................ 333

3.4. Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции................ 337

3.4.1. Регуляция инициации трансляции...................................................... 337

3.4.2. Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей.................... 346

3.4.3. Регуляция терминации трансляции.................................................... 348

3.5. Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина............. 349

3.6. Посттрансляционная регуляция экспрессии генов.................. 351

3.6.1. Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей 352

3.6.2. Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков 354

3.6.3. Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков 355

3.6.4. Сплайсинг белков..................................................................................... 359

3.6.5. Другие посттрансляционные модификации белков........................ 362

Глава 4. ВОСПРОИЗВЕДЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ........... 365

4.1. Репликация ДНК...................................................................................... 365

4.1.1. Белки, участвующие в репликации ДНК............................................. 366

4.1.2. Репликативная вилка E. coli и бактериофага T4.............................. 369

4.1.3. Особенности функционирования репликативной вилки эукариот 374

4.2. Регуляция репликации ДНК................................................................ 377

4.2.1. Инициация репликации ДНК у E. coli и ее регуляция..................... 379

4.2.2. Регуляция репликации плазмиды ColE1............................................ 386

4.3. Особенности репликации линейных геномов............................ 392

4.3.1. Линейные хромосомы бактерий........................................................... 392

4.3.2. Репликаторы эукариот............................................................................. 395

4.3.3. Репликация теломерных участков эукариотических хромосом... 397

4.3.4. Пространственная организация синтеза ДНК у эукариот.............. 398

Глава 5. ЗАЩИТА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ.................................... 401

5.1. Мутации...................................................................................................... 402

5.1.1. Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности 404

5.1.2. SOS-мутагенез у бактерий...................................................................... 419

5.1.3. Мутаторный фенотип............................................................................... 423

5.1.4. Экспансия ДНК.......................................................................................... 425

5.1.5. Адаптивные мутации............................................................................... 428

5.1.6. Механизмы защиты генома от мутаций.............................................. 432

5.2. Репарация ДНК......................................................................................... 433

5.2.1. Основные механизмы репарации поврежденной ДНК.................. 434

5.2.2. Эксцизионная репарация в клетках животных................................. 435

5.2.3. Гомологичная рекомбинация в репарации ДНК.............................. 446

5.2.4. Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов................................ 448

5.2.5. Полимераза поли(ADP-рибозы) в репарации ДНК у эукариот..... 450

5.3. Альтруистичная ДНК............................................................................. 453

5.3.1. Парадокс возможности существования многоклеточных организмов 455

5.3.2. Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями.................................................................... 458

5.3.3. Селективная защита генов от мутаций............................................... 462

5.3.4. Высокоупорядоченое расположение летальных генов на хромосомах 469

5.3.5. Возможный смысл парадокса С............................................................ 477

Глава 6. СОВРЕМЕННАЯ КОНЦЕПЦИЯ ГЕНА................................................ 483

ЧАСТЬ II. ИСКУССТВЕННЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ 492

Глава 7. ПРИНЦИПЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ................................................. 493

7.1. Основные ферменты, используемые в генной инженерии.. 500

7.1.1. Рестриктазы и ДНК-метилазы............................................................... 500

7.1.2. ДНК- и РНК-лигазы................................................................................... 508

7.1.3. Ферменты матричного синтеза ДНК и РНК........................................ 509

7.1.4. Другие ферменты...................................................................................... 515

7.2. Векторы...................................................................................................... 517

7.2.1. Плазмидные векторы............................................................................... 518

7.2.2. Векторы на основе фага l...................................................................... 521

7.2.3. Космиды и фазмиды................................................................................ 524

7.2.4. Сверхъемкие векторы YAC, BAC и PAC............................................ 526

7.2.5. Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы......................... 529

7.2.6. Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование 531

7.2.7. Векторы для переноса ДНК в клетки животных и растений.......... 547

7.3. Клонотеки генов...................................................................................... 549

7.3.1. Получение клонотек генов...................................................................... 549

7.3.2. Введение рекомбинантных ДНК в клетки........................................... 552

7.3.3. Методы скрининга клонотек генов........................................................ 554

7.4. Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток................................................................................. 556

7.4.1. Клетки яичников китайских хомячков (линия CHO)........................ 557

7.4.2. Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0).......................................... 559

7.4.3. Клетки селезенки мышей (линия MEL)............................................... 560

7.4.4. Клетки африканской зеленой мартышки (линия COS)................... 562

7.4.5. Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами............................ 563

7.4.6. Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии. 564

7.5. Бесклеточные белоксинтезирующие системы........................... 565

7.5.1. Прокариотические системы................................................................... 567

7.5.2. Эукариотические системы..................................................................... 570

7.5.3. Проточные системы................................................................................. 571

7.6. Другие современные методы исследования генов.................. 573

7.6.1. Рестрикционное картирование генов................................................. 573

7.6.2. "Прогулки и прыжки по хромосомам".................................................. 574

7.6.3. S1-картирование РНК и ДНК................................................................. 575

7.6.4. Футпринтинг................................................................................................ 576

7.7. Стратегия выделения нового гена.................................................. 577

Глава 8. НАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ И БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ... 580

8.1. Методы направленного получения мутаций............................... 581

8.1.1. Получение делеций и вставок............................................................... 581

8.1.2. Химический мутагенез............................................................................ 583

8.1.3. Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов 585

8.1.4. Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе....... 592

8.2. Белковая инженерия............................................................................. 594

8.2.1. Библиотеки пептидов и эпитопов........................................................ 595

8.2.2. Белки-репортеры в гибридных белках................................................ 602

8.2.3. Гибридные токсины.................................................................................. 603

8.2.4. Подходы к созданию новых ферментов.............................................. 607

8.2.5. Субтилигаза в лигировании пептидов................................................ 612

8.3. Концепция ксенобиоза......................................................................... 615

Глава 9. АНТИСМЫСЛОВЫЕ РНК, РИБОЗИМЫ И ДЕЗОКСИРИБОЗИМЫ 623

9.1. Антисмысловые РНК и олигонуклеотиды.................................... 623

9.1.1. Механизм действия антисмысловых РНК.......................................... 624

9.1.2. Использование антисмысловых РНК.................................................. 626

9.1.3. Природные антисмысловые РНК......................................................... 631

9.1.4. Антисмысловые РНК и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций................................................................................................ 634

9.2. Рибозимы и дезоксирибозимы......................................................... 636

9.2.1. Типы рибозимов........................................................................................ 636

9.2.2. Свойства рибозимов................................................................................ 638

9.2.3. Рибозимы как лекарственные средства............................................. 642

9.2.4. Репарация мутантных РНК с помощью рибозимов, осуществляющих транс- сплайсинг............................................................................................. 647

9.2.5. Дезоксирибозимы..................................................................................... 649

9.3. Аптамеры................................................................................................... 651

9.4. Молекулы РНК у истоков жизни........................................................ 654

9.4.1. Молекулы РНК в качестве РНК-репликаз........................................... 655

9.4.2. Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами РНК... 658

Глава 10. ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ И РАСТЕНИЯ.................................. 663

10.1. Способы получения трансгенных многоклеточных организмов 663

10.2. Экспрессия трансгенов........................................................................ 666

10.3. Использование трансгенов у животных....................................... 667

10.3.1. Исследование механизмов экспрессии генов.............................. 668

10.3.2. Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе................................................................................................................ 669

10.3.3. Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных............................................................................................. 670

10.3.4. Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека 673

10.4. Трансгенные растения......................................................................... 675

10.5. Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний 677

10.5.1. Способы доставки новых генов в геном человека....................... 678

10.5.2. Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях......... 684

10.5.3. Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний 686

10.5.4. Ближайшие перспективы использования генотерапии............. 690

10.5.5. Успехи генотерапии в модельных экспериментах....................... 692

10.5.6. Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии 693

Глава 11. ДНК-ДИАГНОСТИКА И ДНК-ТИПИРОВАНИЕ................................. 695

11.1. ДНК-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний 697

11.1.1. Получение клинического генетического материала.................... 697

11.1.2. Диагностика заболеваний.................................................................. 699

11.2. ДНК-типирование.................................................................................... 710

11.2.1. ДНК-типирование микроорганизмов............................................... 711

11.2.2. Идентификация личности на основе минисателлитной ДНК: определение отцовства............................................................................................. 713

11.3. Микроматрицы и микрочипы ДНК.................................................... 720

11.3.1. Методы создания микроматриц ДНК............................................... 721

11.3.2. Ограничения в использовании микроматриц ДНК...................... 723

11.3.3. Использование микроматриц ДНК в фундаментальных и прикладных исследованиях................................................................................... 725

Глава 12. КАРТИРОВАНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА................................................................................................. 729

12.1. Основные подходы к картированию генома человека........... 729

12.1.1. Генетические карты сцепления......................................................... 730

12.1.2. ПЦР в исследованиях генома человека......................................... 735

12.1.3. Физические карты низкого разрешения.......................................... 737

12.1.4. Физические карты высокого разрешения....................................... 739

12.2. Определение полной первичной структуры ДНК генома человека 740

12.3. Базы данных получаемой информации........................................ 741

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................................... 744

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА.......................................................................... 749

Предисловие редактора

Сей факт с сияющим лицом

Вношу как ценный вклад в науку.

Саша Черный

Науку двигают методы и увенчивают теории. Концептуальные прорывы 1950–1960-х годов – прежде всего, двойная спираль, генетический код и механизм биосинтеза белка – легли в основу молекулярной биологии и молекулярной генетики. Этот начальный период бури и натиска завершился химико-ферментативным синтезом структурного гена аланиновой тРНК дрожжей – событием, которое далеко не все тогда оценили по достоинству. Для скудных методических возможностей того времени это был феноменальный coup de force, потребовавший пятилетних усилий группы высококвалифицированных химиков и биохимиков под руководством Гобинда Кораны, чтобы быть выполненным, и целого номера "Journal of Molecular Biology", чтобы быть описанным. Шокированный последним обстоятельством, журнал "Nature New Biology" устами своего рецензента заявил: «Подобно проекту “Аполлон”, все это сделано лишь для того чтобы показать, что это можно сделать, и, как и этот проект, никогда не будет повторено». Редко случается, чтобы пророчество оказалось настолько бездарным: последующие годы принесли сотни искусственных синтезов такого рода, причем во многих из них использовались основополагающие разработки Кораны. Протагонистом противоположной точки зрения явился Артур Корнберг, который сказал, обращаясь к Коране: “То, что Вы сделали, – это атомная бомба 1980 года”.

Первый синтез гена явился предшественником растянутого во времени большого методического взрыва 1970–1980-х годов в молекулярной биологии. К самым ярким вехам этого взрыва, наряду с олигонуклеотидным синтезом (с переходом его от искусства к ремеслу), можно отнести эндонуклеазы рестрикции, молекулярное клонирование, секвенирование нуклеиновых кислот и полимеразную цепную реакцию. В сочетании с многими другими находками, перечислить которые невозможно, это сделало молекулярную биологию методически почти всемогущей. Будущее покажет, достаточно ли этого, чтобы сбросить покровы с тайны живого.

Бурный поток оригинальных публикаций делает особенно важным жанр обзора в различных его видах. Книга – сложнейший из них, хотя современные возможности работы с литературой далеко отодвинули пределы осуществимого в этой области. Л.И. Патрушев поставил перед собой трудную задачу в одиночку охватить значительную часть современного массива достижений и перспектив молекулярной и клеточной биологии, непосредственно связанную с нуклеиновыми кислотами. На этом пути он сумел сделать удивительно много. Достаточно просмотреть оглавление, чтобы убедиться, что в книге не оставлены без внимания почти все основные направления, имеющие прямое отношение к нуклеиновым кислотам. При этом использован новейший материал, включая множество данных, опубликованных в этом году. Работа не прекращалась ни на минуту, и даже последние числа минувшего октября были свидетелями рождения новых разделов. В результате создано большое молекулярно-биологическое полотно, в котором каждый – от студента до (как это ни кощунственно) академика – может найти для себя что-то неожиданное.

По способу изложения материала квалифицировать книгу непросто. Ее не назовешь учебником в строгом смысле слова, хотя систематичность и внутренняя логика несомненны. Нередко от читателя требуется солидная подготовка, способность истолковывать аллюзии и проскакивать над эллипсисами. Зато удовлетворение от проникновения в материал очень велико.

Эта книга – не просто крупномасштабная компиляция. На ней отчетливо видна печать личности автора. Чувствуется, как небезразлично ему все то, что вот уже несколько десятиле