Культивирование бактерий

Для культивирования бактерий необходимы следующие условия. - Полноценная питательная среда.

Искусственные питательные среды должны отвечать следующим требованиям:

■ каждая питательная среда должна содержать воду, так как в ней протекают все процессы жизнедеятельности бактерий;

■ для культивирования гетероорганотрофных бактерий в среде должны содержаться органические источники углерода и энергии (углеводы, аминокислоты, органические кислоты, липиды);

■ для биосинтетических процессов бактериям требуются источники азота, серы, фосфаты, микроэлементы. Источником азота служит пептон - продукт неполного гидролиза белков, поставляющий аминокислоты для построения бактериальных белков. Бактерии способны утилизировать минеральные вещества в виде неорганических солей;

■ поддержание определенного рН имеет значение для предотвращения гибели микроорганизмов от ими же образованных продуктов обмена;

■ среда должна обладать определенным осмотическим давлением. Большинство бактерий способны расти на изотонических средах, чего достигают добавлением NaCl в концентрации 0,87%;

■ питательные среды должны быть стерильными.

В зависимости от консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими и плотными. Плотность среды достигается добавлением агара.

Агар - полисахарид, получаемый из водорослей. Он плавится при температуре 100 °C, а при охлаждении остывает при 45-50 °C. Агар добавляют в концентрации 0,5% для создания полужидких сред и в концентрации 1,5-2% - для плотных. В зависимости от состава и цели применения различают простые, сложные, элективные, дифференциально-диагностические и комбинированные среды.

К простым средам относятся пептонная вода, питательный бульон, мясопептонный агар. На основе этих простых сред готовят сложные среды, например, сахарный и сывороточный бульоны, кровяной агар.

В зависимости от назначения среды подразделяются на элективные, среды обогащения и дифференциально-диагностические.

На элективных средах лучше растет какой-то определенный микроорганизм. Например, щелочной агар, имеющий рН = 9,0, служит для выделения холерного вибриона. Другие бактерии, в частности кишечная палочка, из-за высокого рН на этой среде не растут.

Среды обогащения стимулируют рост какого-то определенного микроорганизма, ингибируя рост других. Например, среда, содержащая селенит натрия, стимулирует рост бактерий рода Salmonella, ингибируя рост кишечной палочки.

Дифференциально-диагностические среды служат для изучения ферментативной активности бактерий. Они состоят из простой питательной среды с добавлением субстрата, на который должен подействовать фермент, и индикатора, меняющего свой цвет в результате ферментативного превращения субстрата. Например, среды Гиса (рис. 4.3 а) используют для изучения способности бактерий ферментировать сахара; среда Клиглера позволяет дифференцировать бактерии по способности ферментировать глюкозу, лактозу и продуцировать сероводород (рис. 4.3 б).

Комбинированные среды сочетают элективную среду, подавляющую рост сопутствующей микрофлоры, и дифференциальную среду, диагностирующую ферментативную активность выделяемого микроорганизма. Примерами таких сред служат среда Плоскирева и висмут-сульфитный агар, используемые при выделении патогенных кишечных бактерий. Эти среды ингибируют рост кишечной палочки.

- Температура культивирования.

Температура влияет на скорость размножения. По отношению к температуре роста бактерии разделяются на три основные группы: психрофилы, мезофилы и термофилы. Психрофилы живут и размножаются при пониженных температурах (от -10 до +20 °C). Мезофилы имеют температурный диапазон роста между 30 и 45 °C. К этой группе относится большинство возбудителей болезней человека, оптимальный рост которых возможен при температуре 37 °C. Термофилы способны расти при повышенных температурах.

Для поддержания требуемой температуры используют специальные приборы - термостаты.

- Атмосфера культивирования.

ля роста и размножения строгих аэробов необходим кислород. Аэробы хорошо растут на поверхности агара на чашках Петри или в тонком верхнем слое жидкой среды. Факультативные анаэробы культивируют в аналогичных условиях.

Рис. 4.3 а. Дифференциально-диагностические среды. Среды Гиса

Рис. 4.3 б. Дифференциально-диагностические среды. Рост представителей семейства Enterobacteriaceae на среде Клиглера: 1 - среда до посева; 2 - Salmonella; 3 - Escherichia; 4 - Shigella; 5 - Salmonella Typhi

Микроаэрофилы, нуждающиеся в пониженной концентрации кислорода, культивируют в атмосфере 5% в специальных СО2-инкубаторах или же посевы помещают в эксикаторы, в которых устанавливают горящую свечу.

Облигатные анаэробы для своего роста и размножения требуют исключения доступа кислорода воздуха. Этого достигают следующими мерами:

■ добавлением к питательным средам редуцирующих кислород веществ - тиогликолевой, аскорбиновой кислот;

■ освобождением от кислорода воздуха жидких питательных сред путем их кипячения с последующим плотным закупориванием сосудов, в которые налиты среды, резиновыми пробками;

■ использованием поглотителей кислорода, помещая их в герметически закрываемые емкости - «Газпаки»; этот метод используют для культивирования аэротолерантных бактерий;

■ механическим удалением кислорода воздуха с последующим заполнением емкости инертным газом (для этих целей используют анаэростаты и анаэробные боксы).

Время культивирования зависит от времени генерации. Большинство бактерий культивируют для получения видимого роста в течение 18-48 ч. Для культивирования возбудителя коклюша требуется 5 сут, а для М. tuberculosis - 3-4 нед. - Освещение.

Для выращивания фототрофных микроорганизмов необходим свет. Некоторые условно патогенные микобактерии в зависимости от освещенности образуют пигмент, который используют при их идентификации. Культивирование абсолютных внутриклеточных паразитов, бактерий, относящихся к родам Rickettsia, Chlamydia, осуществляют на культурах клеток или в организме животных и членистоногих, а также на куриных эмбрионах.