Методы культивирования риккетсий,хламидий,микоплазм

Микоплазмы - самые мелкие прокариоты (125-150 нм) способные самостоятельно размножаться. Полагают, что микоплазмы являются наиболее близкими потомками исходных прокариотических клеток. Геном микоплазм минимален для клетки, он в пять раз меньше генома кишечной палочки и составляет 0,45 МД. Главная особенность микоплазм - отсутствие клеточной стенки. Они окружены капсулоподобным слоем, под которым находится лишь тонкая трехслойная мембрана толщиной 7,5- 10 нм, содержащая в значительном количестве холестерин. Вследствие этого, микоплазмы выделяют в особый отдел Tenericutes, класс Mollicutes («нежная кожа»), порядок Mycoplasmatales.
Из-за отсутствия клеточной стенки микоплазмы (рис. 2) осмотически чувствительны и имеют разнообразную форму:

• мелкие сферические или овоидные клетки размером 0,2 мкм (элементарные тельца) которые фильтруются через бактериальные фильтры;
• более крупные шаровидные, размером до 1,5 мкм;
• нитевидные, ветвящиеся клетки размером до 150 мкм.

Микоплазмы не образуют спор, жгутиков, некоторые виды обладают скользящей подвижностью.
Размножаются путем бинарного деления шаровидных и нитевидных клеток, почкования и высвобождения множества элементарных телец, образующихся в нитях.

Для микоплазм характерна уникальная для прокариот потребность в стеролах (холестерине). Холестерин стабилизирует мембрану мико-
плазм. В инфицированных тканях микоплазмы являются паразитами мембран эукариотических клеток и способны персистировать на них долгое время.
Что касается энергии, то микоплазмы получают ее обычным для факультативных анаэробов способом, ферментируя углеводы или аминокислоты. Вследствие малого генома микоплазмы обладают ограниченными биосинтетическими способностями, и их приходится культивировать на питательных средах обогащенных липидами,
белками, предшественниками нуклеиновых кислот. Растут медленно, колонии с плотным врастающим в среду центром, напоминающие «яичницу-глазунью» (темный центр и более светлая ажурная периферия). Размеры колоний мелкие, не превышающие 600 мкм.

Большинство микоплазм являются безвредными комменсалами слизистых оболочек глаз, дыхательных, пищеварительных и мочеполовых путей человека.
В патологии человека наибольшую роль играют несколько представителей рода Mycoplasma: M. pneumoniae, M. hominis, M. anthritidis и единственный вид рода Ureaplasma - U. urealyticum (названный так из-за уреазной активности). Патогенные микоплазмы вызывают заболевания (микоплазмозы) дыхательных, мочеполовых путей и суставов с разнообразными клиническими проявлениями. При лечении этих заболеваний следует помнить, что микоплазмы не чувствительны к бета-лактамным антибиотикам и другим лекарственным препаратам, угнетающим синтез клеточной стенки (из-за ее отсутствия у возбудителя).
Методы исследования. В световом микроскопе обнаруживаются лишь самые крупные формы микоплазм. В живом состоянии их изучают в темнопольном и фазово-контрастном микроскопе, ультраструктурные компоненты выявляют при помощи электронной микроскопии.

Риккетсии- мелкие (0,35-1.0 мкм) грамотрицательные, полиморфные бактерии, являющиеся облигатными внутриклеточными паразитами.
Риккетсии разнообразны по форме и выделяют следующие типы:

• кокковидные однозернистые (до 0,5 мкм);
• палочковидные двухзернистые (1-1,5 мкм);
• бациллярные трех-четырехзернистые (3-4 мкм);
• нитевидные многозернистые (10-40 мкм).

Зерна (нуклеопротеиды) обнаруживаются при окраске по Романовскому-Гимзе. Все формы взаимообратимы. Структурно имеют все компоненты бактериальной клетки: клеточную стенку, липоидную капсулу, цитоплазму, нуклеоид, рибосомы, пили. Риккетсии содержат как ДНК, так и РНК, обладают высоким содержанием фосфолипидов, содержание углеводов невелико. В большинстве случаев (кроме вида Rochalimaea guintana) на искусственных питательных средах риккетсии не растут. Жизненный цикл риккетсий зависит от жизнедеятельности клетки-хозяина и складывается из двух стадий: вегетативной и покоящейся (элементарные тельца). Риккетсии, находящиеся в вегетативной стадии активно размножаются путем бинарного деления и обладают активной подвижностью, по-видимому, обусловленной жгутиковыми структурами. Риккетсии покоящейся стадии (элементарные тельца) имеют сферическую форму и они не активны. Риккетсии способны к биосинтезу белка, но не могут самостоятельно получать макроэргические соединения, поэтому их можно назвать «энергетическими паразитами» клеток-эукариотов. В связи с этим, для культивирования риккетсий обычно заражают куриные эмбрионы в желточный мешок (метод Кокса), культуры клеток, в которых некоторые виды риккетсий образуют, как и вирусы, тельца включений. Реже заражают чувствительных лабораторных животных: морских свинок, белых мышей.
Порядок Rickettsiales включает виды патогенные для теплокровных животных и человека, переносчиками служат вши, блохи, клещи. Заболевания называются риккетсиозами. Большинство болезнетворных для человека видов риккетсий входит в состав семейства Rickettsiaceae, роды Rickettsia, Rochalimaea, Coxiella, вызывая эпидемический сыпной тиф (Rickettsia prowazekii), Ку-лихорадку (Coxiella burnetti), волынскую лихорадку (Rochalimaea guintana), лихорадку цуцугамуши (Rickettsia tsutsugamushi) и другие. Паразитирующие виды ассоциированы с ретикулоэндотелиальными клетками и клетками Методы исследования. Риккетсии хорошо окрашиваются по Романовскому-Гимзе в сиреневый цвет, по Морозову (методом серебрения) в черный цвет
Для дифференциации риккетсий применяется метод окраски, предложенный П.Ф. Здродовским:

• Тонкие фиксированные мазки окрашиваются водным карболфуксином (из расчета 10 капель карболового фуксина Циля на 10 мл фосфатного буфера рН - 7,4) в течение 5 мин.
• Мазок промывают водой и обрабатывают 0,5% раствором лимонной кислоты (1-3 сек).
• Хорошо промывают водой и докрашивают 10 сек, 0,5% водным раствором метиленового синего.
• Промывают водой и высушивают.

Риккетсии окрашиваются в рубиново-красный цвет и легко обнаруживаются на фоне голубой цитоплазмы и синего ядра клеток.

Хламидии- неподвижные, облигатно паразитические, кокковидные бактерии. Размножаются только внутри связанных с мембраной вакуолей в цитоплазме клеток человека, млекопитающих, птиц. Членистоногие не служат хозяевами или переносчиками. Размножение происходит в ходе уникального цикла развития. Основными стадиями жизненного цикла хламидий являются:

• Элементарные тельца - мелкие (0,2-0,5 мкм) электронноплотные шаровидные структуры, лишенные метаболитной активности, имеющие компактный нуклеоид и ригидную клеточную стенку, которые фильтруются через бактериальные фильтры. Они являются инфекционным началом хламидий и обеспечивают их выживание во внеклеточной среде и заражение новых клеток.
• Ретикулярные тельца - более крупные (0,8-1,5 мкм), сферические образования, имеющие сетчатую структуру с тонкой клеточной стенкой и фибриллярным нуклеоидом. Они вырастают из элементарных телец внутри клеток, лишены инфекционности и, подвергаясь делению, обеспечивают репродукцию хламидий. Отсюда другое, исторически первое название ретикулярных телец - «инициальное тело». Ретикулярные тельца являются вегетативной формой хламидий.
• Промежуточные тельца - промежуточная стадия между элементарными и ретикулярными тельцами.

Жизненный цикл хламидий начинается с того, что элементарные тельца фагоцитируются клеткой-хозяином, а затем в течение нескольких часов реорганизуются, увеличиваются в размерах и превращаются в ретикулярные формы, которые размножаются путем поперечного деления. Жизненный цикл заканчивается, когда возникающие промежуточные формы уплотняются, уменьшаются в размерах и превращаются в элементарные тельца. Размножаясь внутри цитоплазматических вакуолей, хламидии образуют микроколонии (включения), окруженные мембраной. В составе микроколоний обнаруживаются все три стадии развития хламидий. После разрыва стенки вакуоли (везикулы) и мембраны клетки-хозяина, вновь образовавшиеся хламидии высвобождаются, и элементарные тельца, инфицируя другие клетки, повторяют цикл развития. В оптимальных условиях роста в эукариотических клетках жизненный цикл хламидий составляет 17-40 часов. Хламидии хорошо размножаются в желточном мешке куриного эмбриона при температуре от 33 ^o - 44 ^o С, а также в культурах клеток различных позвоночных. Зависимость хламидий от клеток-эукариотов объясняется их неспособностью аккумулировать и использовать энергию, так как они не могут синтезировать АТФ. В этом отношении хламидии похожи на риккетсий, в связи с чем, эти микроорганизмы также называют «энергетическими паразитами». Своеобразие хламидий проявляется и в строении их клеточной стенки. Она лишена пептидогликана и представляет собой двухслойную мембрану, ригидность которой определяют пептиды, перекрестно сшитые дисульфидными мостиками. В остальном хламидии напоминают грамотрицательные бактерии, так как содержат гликолипиды, сходные с липополисахаридами (рис. 6).
Порядок Chlamydiales включает одно семейство Chlamydiaceae с единственным родом Chlamydia. Для человека патогенны виды C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniae. Хламидии вызывают у людей заболевания глаз, дыхательной и мочеполовой систем и объединяются под общим названием «хламидиозы».
Методы исследования. Для микроскопического обнаружения телец включений (микроколоний) хламидий в инфицированных клетках (тканях) применяют различные методы окрашивания: Романовского-Гимзы, Маккиавелло и другие. При окрашивании по Романовскому-Гимзе они приобретают голубой или фиолетовый цвет. Кроме того, хламидии хорошо видны и в неокрашенном состоянии при микроскопии влажных препаратов под стеклом с помощью фазовоконтрастной оптической системы. В последнее время наиболее часто используется прямая реакция иммунофлюоресценции, окраска акридин -оранжевым.

Международная классификация и характеристика ферментов бактерий. Методы определения гликолитических и протеолитических ферментов бактерий. Идентификация бактерий по ферментативной активности.

Питание микроорганизмов осуществляется благодаря наличию в клетке различных ферментов, катализирующих все жизненно необходимые реакции. Ферменты - это биологические катализаторы белковой природы. Микробная клетка, подобно клеткам высших организмов, оснащена достаточно активным ферментативным аппаратом. Ферменты микроорганизмов обладают теми же свойствами и функциями, что и ферменты высших организмов. В соответствии с катализирующими реакциями все ферменты разделяют на шесть классов:

• Оксидоредуктазы - катализируют реакции окисления-восстановления.
• Трансферазы - катализируют реакции переноса различных групп от донора к акцептору.
• Гидролазы - катализируют разрыв связей в субстратах с присоединением воды.
• Лиазы - катализируют реакции разрыва связей в субстрате без присоединения воды или окисления.
• Изомеразы - катализируют превращения в пределах одной молекулы (внутримолекулярные перестройки).
• Лигазы (синтетазы) - катализируют присоединение двух молекул с использованием энергии фосфатных связей.

Несмотря на малые размеры микробной клетки, распределение в ней ферментов строго упорядоченно. Ферменты энергетического обмена и транспорта питательных веществ локализованы в цитоплазматической мембране и ее производных. Ферменты белкового синтеза связаны с рибосомами. Многие ферменты не связаны с определенными структурами клетки, а находятся в цитоплазме в растворенном виде.
Ферменты бактерий подразделяются на экз о- и эндоферменты. Эндоферменты функционируют только внутри клетки. Они катализируют реакции биосинтеза и энергетического обмена. Экзоферменты выделяются клеткой в среду и катализируют реакции гидролиза сложных органических соединений на более простые, доступные для ассимиляции микробной клеткой. К ним относятся гидролитические ферменты, играющие исключительно важную роль в питании микроорганизмов.
В зависимости от условий образования ферментов их разделяют на конститутивные и индуцибельные. Конститутивными называют ферменты, синтезируемые клеткой вне зависимости от субстрата, на котором развиваются бактерии. Например, ферменты гликолиза. Индуцибельные ферменты синтезируются только в ответ на присутствие в среде необходимого для клетки субстрата-индуктора. Он взаимодействует с репрессором, инактивирует его, в результате чего включается генетический аппарат клетки и начинается синтез соответствующего фермента. Индуцированный синтез ферментов идет, пока в среде присутствует индуктор. При этом ферменты синтезируются заново во всех клетках одновременно. Индукторами биосинтеза являются многие питательные вещества. К индуцибельным относится большинство гидролитических ферментов.

Известны также ферменты, которые получили название аллостерических. Кроме активного центра у них имеется регуляторный или аллостерический центр, который в молекуле фермента пространственно разделен с активным центром. Аллостерическим (от греч. allos - иной, чужой) он называется потому, что молекулы, связывающиеся с этим центром, по строению (стерически) не похожи на субстрат, но оказывают влияние на связывание и превращение субстрата в активном центре, изменяя его конфигурацию. Молекула фермента может иметь несколько аллостерических центров. Вещества, связывающиеся с аллостерическим центром, называют аллостерическими эффекторами. Они влияют через аллостерический центр на функцию активного центра: или облегчают ее, или затрудняют. Соответственно аллостерические эффекторы называются положительными (активаторы) или отрицательными (ингибиторы). Аллостерические ферменты играют важную роль в тонкой регуляции метаболизма бактерий. Поскольку практически все реакции в клетке катализируются ферментами, регуляция метаболизма сводится к регуляции интенсивности ферментативных реакций.
Некоторые ферменты, так называемые ферменты агрессии, разрушают ткани и клетки макроорганизма, обуславливая тем самым распространение патогенных микроорганизмов и их токсинов в инфицированных тканях. К таким ферментам относятся плазмокоагулаза, нейраминидаза, коллагеназа, лецитиназа, гиалуронидаза и некоторые другие ферменты. Гиалуронидаза стрептококков, например, расщепляет гиалуроновую кислоту в мембранах клеток соединительных тканей макроорганизма, что способствует распространению возбудителей и их токсинов в организме, обуславливая высокую инвазивность этих бактерий.
Плазмокоагулаза является главным фактором патогенности стафилококков, так как участвует в превращении протромбина в тромбин, который вызывает образование фибриногена, в результате чего каждая бактерия покрывается пленкой, предохраняющей ее от фагоцитоза. Ферменты микроорганизмов, такие как лигазы и рестриктазы, нашли широкое применение в биотехнологии, в том числе в генетической инженерии, для получения различных биологически активных веществ, гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, а также ряда продуктов в легкой и пищевой промышленности.
Ферменты микроорганизмов характеризуют их биологические свойства и поэтому их исследуют с целью идентификации бактерий. В зависимости от субстрата гидролитические ферменты принято делить на две большие группы:

• гидролитические или сахаролитические ферменты, субстратом для которых являются различные сахара, а продуктами их расщепления - кислоты, спирты, альдегиды, Н₂О и СО₂;
• протеолитические ферменты, расщепляющие белки с образованием полипептидов, аминокислот, аммиака, индола, сероводорода.

Для изучения активности ферментов при идентификации микроорганизмов широко используют дифференциально-диагностические среды, в состав которых входят определенные субстраты - сахара или белки.
При исследовании гидролитической активности бактерий распространены моносубстратные дифференциально-диагностические среды Гисса (пестрый ряд Гисса), лактозосодержашие среды Эндо, Левина, Плоскирева, дисубстратные среды Ресселя, полисубстратные среды Клиглера и Олькеницкого. Последние могут служить и для изучения протеолитических свойств бактерий, так как рост микроорганизмов сопровождается высвобождением аммиака. Протеолитические ферменты бактерий определяются также по выделению индола, сероводорода, расщеплению некоторых аминокислот, например, фенилаланина, лизина, цистина. Протеолитические ферменты способны изменять (разжижать) желатину, причем, разные виды бактерий по разному изменяют «столбик» желатины в пробирке с посевом микроорганизма. Так, при росте холерного вибриона «столбик» желатины принимает форму гвоздя, при росте стафилококка - чулка, при росте синегнойной палочки наблюдается послойное разжижение среды.
Окислительно-восстановительные ферменты, дегидрогеназы, каталазу определяют по изменению органического красителя - акцептора водорода. Способность микроорганизмов использовать в качестве источника углерода цитрат оценивают в специальных тестах основанных на работе ферментов.
В практических бактериологических лабораториях широко применяют микр о- и экспресс-методы для ориентировочного изучения биохимических свойств микроорганизмов. Для этой цели существует множество тест-систем. Наиболее часто используют систему индикаторных бумаг (СИБ). СИБы представляют из себя диски фильтровальной бумаги, пропитанные растворами сахаров или других субстратов в сочетании с индикаторами. Такие диски опускают в пробирку с выросшей в жидкой питательной среде культурой. По изменению цвета диска с субстратом судят о работе фермента. Микро-тест системы для изучения идентификации энтеробактерий представлены одноразовыми пластиковыми контейнерами со средами, содержащими различные субстраты, с добавлением индикаторов. Посев чистой культуры микроорганизмов в такие тест-системы позволяет быстро выявить способность бактерий утилизировать цитраты, глюкозу, сахарозу, выделять аммиак, индол, разлагать мочевину, лизин, фенилаланин и т.д.