Методы лабораторной диагностики инфекционного заболевания – бруцелеза

Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических антител в сыворотке крови животных при помощи реакции агглютинации в пробирках (РА), реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК), пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба, РБП) и в молоке коров при помощи кольцевой реакции (КР).

Постановка и учет результатов реакции агглютинации в пробирках (РА).

Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей, собак, пушных зверей и животных других видов.

Компоненты реакции агглютинации:

испытуемые сыворотки крови;

позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от больного бруцеллезом животного.

На этикетке флакона с такими сыворотками указывают титры в РА и РСК и дату изготовления:

негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная биопредприятием или полученная в лаборатории;

антиген бруцеллезный, единый для РА, РСК и РДСК;

раствор хлорида натрия.

При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и антигена используют фенолязировэнный. (0,5%-ный) физиологический раствор хлорида натрия (0,85%-ный), при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов — 5%-ный и оленей — 10%-ный фенолизированный раствор хлорида натрия

Постановка реакции агглютинации.

Реакцию агглютинации проводят в объеме 1 мл в четырех разведениях:

при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов, оленей и собак — 1: 25, 1: 50, 1: 100 и 1: 200;

крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — 1: 50, 1: 100, 1: 200 и 1: 400;

пушных зверей и морских свинок — 1:10, 1: 20, 1: 40 и 1: 80.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.

Разлив компонентов реакции проводят индивидуальными мерными пипетками или групповыми дозаторами Флоринского.

Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках первого ряда делают основное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирки и добавляют к ней 2,4 мл соответствующего раствора хлорида натрия (получают разведение сыворотки 1: 25). Сыворотку крови овец, коз, буйволов, оленей и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1: 12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1: 5). Таким образом делают основное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда штатива (по 10 проб в ряду).

После приготовления основного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вливают по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского переносят в пробирки второго и третьего рядов по 0,5 мл основного разведения сывороток (1: 2о, 1: 12,5 или 1:5). В пробирках третьего ряда сыворотки смешивают с раствором хлорида натрия, по 0,5 мл этого разбавления переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда — в пятый. Из пробирок пятого ряда по 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные разведения одновременно 10 сывороток.

После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разбавленного в соотношении 1: 10 соответствующим раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сывороток в каждой пробирке удваивается и в зависимости6t вида исследуемых животных будет составлять соотношения: 1: 50;!: 100, 1: 200 и 1: 400; 1: 25; 1: 50; 1: 100 и 1: 200 или 1: 10; 1: 20, 1: 40 и 1: 80.

В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, и они служат контролем качества сыворотки При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты реакции агглютинации не учитывают.

При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей) или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл (при исследовании сывороток овец, коз, буйволов, оленей и собак). Затем а каждую пробирку по 1,0 мл антигена, разведенного соответствующим раствором хлорида натрия в соотношении 1: 20. При этом разведения сывороток будут соответствовать соотношениям 1: 50 и 1: 100 или 1: 25 и 1: 50.

При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят контроли:

с негативной сывороткой в тех же разведениях, как с испытуемыми; с позитивной бруцеллезной сывороткой в разведениях до ее предельного титра.

После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками осторожно встряхивают и помещают в термостат при 37—38°С на 16—20 ч, затем.выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего проводят учет реакции.

Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в крестах по следующей схеме:

(++++) — полное просветление жидкости, микробные тела антигена осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);

(+++) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный «зонтик» (75% агглютинации);

(++) — просветление жидкости, «зонтик» умеренно выражен (50% агглютинации);

(+) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик» выражен слабо, при встряхивании заметно небольшое количество хлопьев или комочков (25% агглютинации);

(—) — просветления жидкости и образования «зонтика»

не наступило, на дне пробирки виден «пунктик» осевших микробов антигена, при легком встряхивании образуется равномерная взвесь.

За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц (ME) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с конечным титром РА 1: 100 содержит 100 ME, 1: 200—200 ME и т. п.).

Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности, соответствующие 0, 25, 50 и 75% просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1: 10. Затем в том же порядке в три первых пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл фенолизированного физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания пробирок жидкость из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по 0,5 мл фенолизированного физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50 и 25% просветления жидкости. В последней, четвертой, пробирке просветление отсутствует. Стандарты мутности готовят каждый раз при поставке РА и выдерживают в термостате одновременно с основной реакцией.

Степень просветления в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют визуально путем сравнения со стандартами и результаты реакции выражают в крестах.

При массовых исследованиях сывороток в двух разведениях все сыворотки, давшие агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных -разведений, исследуют повторно в четырех разведениях.

Диагностическая оценка реакции агглютинации.

Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов, начиная с разведения 1: 100 (100 ME антител); коз, овец, буйволов, оленей и собак — с разведения 1: 50 (50 ME); пушных зверей и морских свинок — с разведения 1: 10 (10 ME) с оценкой не менее чем на 2 креста.

Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации только в разведении 1: 50 (50 ME) с сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов и в разведении 1: 25 (25 ME) с сыворотками овец, коз, буйволов, оленей и собак с оценкой не менее чем на 2 креста.

При получении сомнительного результата реакции сыворотку крови данного животного исследуют повторно через 3—4 нед.

На неблагополучных по бруцеллезу фермах животных, при исследовании которых будет получена дважды сомнительная РА, относят к положительно реагирующим.

В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр) сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженное в международных единицах (например: конечный титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1: 100 с оценкой 2 креста или более — «положительная 100 ME»; конечный титр сыворотки 1: 50 с оценкой 2 креста или более — «сомнительная 50 ME»).

Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его годности, а также предельный титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических исследований.