Лабораторная работа №10

Тема «Разделение белка и низкомолекулярных примесей методом гельфильтрации на сефадексе G 25 (по С. Р. Мардашеву, А. А. Покровскому, Н. А. Павловой, с дополнениями)» (2 часа)

Цели:

1. Систематизация знаний о физико-химических методах анализа

2. Систематизация знаний о физико-химических свойствах аминокислот и белков

3. готовностью использовать основные методы защиты от возможных последствий аварий, катастроф, стихийных бедствий (ОК-11) профиль подготовки: Физическая культура. Безопасность жизнедеятельности (очная форма обучения);

4. способностью использовать возможности образовательной среды для формирования универсальных видов учебной деятельности и обеспечения качества учебно-воспитательного процесса (ПК-5) профиль подготовки: Физическая культура. Безопасность жизнедеятельности (очная форма обучения).

Содержание

Разделение белка и низкомолекулярных примесей методом гельфильтрации на сефадексе

Обработка результатов анализа

Формулирование выводов

Работа с вопросами и расчетными задачами

Требования к умениям бакалавров

Знать

Особенности аминокислот и белков как буферных соединений

Термины

Уметь

Готовить образцы для анализа

Решать задачи по соответствующему разделу

Проводить качественный, количественный анализ

Метод гельфильтрации (гельхроматографии) широко используется в биохимии и биохимической технологии для фракционирования и очистки высокомолекулярных веществ, концентрирования их в растворах, обессоливания биологических субстратов, определения молекулярного веса и т. д. Он основан на способности низкомолекулярных веществ проникать внутрь частиц наполнителя. В то же время большие частицы высокомолекулярных соединений проходят мимо частиц геля, вследствие чего скорость прохождения веществ через колонку с наполнителем будет различной: высокомолекулярные соединения фильтруются быстрее, а низкомолекулярные задерживаются на колонке.

При гельфильтрации широко применяются сефадексы. Сефадексы — высокополимерные поперечносшитые полисахариды (декстраны), обладающие сильно гидрофильными свойствами. Они устойчивы к действию органических растворителей, растворов щелочей и разбавленных кислот, разрушаются сильными кислотами (например, 0,1 н раствором соляной кислоты) и сильными окислителями.

Сефадексы различаются размерами частиц, а также количеством поперечных связей («сшивок»), что в свою очередь определяет степень набухания высокополимера. Различные марки сефадекса отличаются способностью к набуханию, на которую указывает номер геля. Номер определяет десятикратное количество воды, которое может удержать 1 г сухого сефадекса. Так, например, 1 г сефадекса G-15 способен поглотить 1,5 мл воды, сефадекса G-25—2,5 мл.

Для расчета количества сефадекса, необходимого для заполнения колонки, надо знать его удельный объем, который будет занимать 1 г сухого полисахарида после набухания. Для сефадекса G-25 эта величина составляет 4—6 см³/г (в среднем 5). Объем колонки следует разделить на удельный объем сефадекса. Полученная величина укажет требующееся количество граммов сухого сефадекса.

Рекомендуемые размеры колонки 1,8X20 см, объем — 50,8 см³. Чтобы ее заполнить, потребуется 50,8: 5= 10,16 г сефадекса.

Подготовка сефадекса и заполнение колонки. Сухой сефадекс суспендируется в большом объеме дистиллированной воды. После осаждения основной массы сефадекса надосадочную жидкость с мельчайшими частицами геля декантируют. Эту-операцию отмывки повторяют несколько раз, пока надосадочная жидкость не будет содержать мельчайших частиц. Для отмывки и набухания сефадекса требуется 3 часа.

Колонка представляет собой цилиндрический стеклянный сосуд высотой 20—25 см и диаметром 1,8 см, с краном внизу. В качестве колонки можно использовать широкую бюретку со стеклянным краном. Ее укрепля­ют строго вертикально в штативе. На дно колонки кладут кусочек стеклянной ваты, на него кружок фильтровальной бумаги, вырезанный по диаметру колонки, и затем на 1/3 объема колонки наливают фосфатный буфер (рН 6,8). Открывают кран и заполняют узкую нижнюю часть колонки буфером, далее через воронку, по палочке наливают небольшими порциями суспензию сефадекса и заполняют колонку гелем приблизительно на 70% высоты. Показателем правильного заполнения колонки является строго горизонтальная поверхность геля в ней. После заполнения колонки ее уравновешивают фосфатным буфером (рН 6,8) так, чтобы рН раствора на входе и выходе из колонки был одинаковым.

Вопросы

1. Какова тканевая и органная специфичность аминотрансфераз? Показать ее на примере АлАТ и АсАТ, отметить диагностическое значение этих ферментов.

2. Реакция декарбоксилирования аминокислот – путь образования биогенных аминов, отметить биологическую роль последних.

3. Витамин В6 –кофермент аминотрансфераз и декарбоксилаз α-аминонокислот. Его ключевая роль в общем обмене аминокислот. Показать его строение и механизм действия.

4. Какие виды биологического дезаминирования известны? Показать реакции и отметить те из них, которые присущи организму человека.

5. Окислительное дезаминирование глутаминовой кислоты – основной путь выведения аминокислотного азота.

6. Каков механизм глутаматдегидрогеназной реакции? Рассмотреть схему механизма реакции, участвующие в ней коферменты. Показать ее возможную обратимость и органоспецифичность прямой и обратной реакции. Биологическая роль обратной реакции.

7. Что такое непрямое дезаминирование? Дать определение и схему реакций. Отметить тканевые особенности этого процесса (в печени, нервной и мышечной тканях).

8. Что такое моноаминооксидазная реакция? Показать ее механизм и отметить ее биологическую роль.

9. Рассмотреть пути катаболизма безазотистых остатков аминокислот: глюконеогенез (глюкагенные аминокислоты), кетогенез (кетогенные аминокислоты), включение в ЦТК.

10. В чем заключается биологическая роль глутамина и аспарагина? Показать механизм глутаминсинтетазной реакции, ее тканевые особенности. Отметить ее роль в срочной детоксикации аммиака, а также роль различных азотсодержащих метаболитов.

11. В чем заключается биологическая роль мочевины? Отметить ее значение как конечного продукта обезвреживания и выведения аммиака.

12. Что такое орнитиновый цикл? Рассмотреть реакции цикла, дать характеристику ферментам, отметить его органоспецифичность.

13. Показать связь орнитинового цикла с обменом аминокислот, с ЦТК, с окислительным фосфорилированием, отметить роль цикла как источника аргинина.

14. Что может быть причиной недостаточности орнитинового цикла? Отметить два типа причин: 1) патологические изменения печени (уменьшение клеточной паренхимы); 2) генетически обусловленная недостаточность ферментов цикла.

15. Каковы последствия недостаточности орнитинового цикла? Отметить: 1) снижение содержания мочевины в крови и моче; 2) повышение содержания аммиака в крови (гипераммониемия).

16. Рассмотреть биохимические причины токсичности аммиака, метаболические и клинические последствия гипераммониемии.

17. В чем заключается клиническое значение определения уровня мочевины в крови? Подробно рассмотреть диагностическую роль этого показателя в оценке состояния почек, печени и обмена белка в организме.

18. Привести реакции превращения глутаминовой кислоты в ГАМК, ГОМК и янтарную кислоту. Показать значение этого пути в энергетическом обмене, связать его с антигипоксическим и адаптогенным действием глутаминовой кислоты. Отметить биохимические причины антиоксидантной активности глутаминовой кислоты.

19. Рассмотреть нейромедиаторные свойства ГАМК и ГОМК, связать это с их лекарственным применением

20. Рассмотреть общую схему обмена фенилаланина и указать на биологическое значение каждого из путей: катехоламиновый – источник гормонов и нейромедиаторов; мелатониновый – источник пигментов; гомогентизиновый – катаболический с использованием конечных продуктов в энергетическом обмене.

21. Рассмотреть энзимопатии, связанные с нарушением обмена фенилаланина: фенилкетонурию, альбинизм, алкаптонурию. Указать их биохимические причины (точки ферментативной недостаточности), метаболические сдвиги и клинические проявления. Рассмотреть схему кинуренинового пути обмена триптофана, его роль в снижении потребности организма в витамине РР.

22. Показать участие витамина В₁₂ и ТГФК в переносе одноуглеродных фрагментов. Рассмотреть реакцию образования ТГФК как активацию фолиевой кислоты, роль в ней фолатредуктазы

23. Показать значение метионина как источника метильных групп в реакциях биологического метилирования: образование метилирующего агента - S-аденозилметионина, роль в этом цикле ТГФК и витамина В₁₂.

24. Принцип гельфильтрации, условия использования

25. Строение сефадекса

Средства контроля: -активные формы: фронтальный опрос; доклады по рефератам «Обмен белков».

Тест Белки, аминокислоты (см. Тестовый контроль знаний по биохимии: методическое пособие. – Ульян. гос. пед. ун-т им. И. Н. Ульянова. – Ульяновск: УлГПУ, 2010. - 28 с.)

Содержание внеаудиторной работы бакалавра при подготовке к занятию

1.Владеть содержанием вопросов (по лекции).

2.Законспектировать вопрос: Обмен веществ между организмом и окружающей средой как основное условие жизни. Ассимиляция (анаболизм) и диссимиляция (катаболизм). Пластический и функциональный обмен.

3.Подготовиться к диагностической самостоятельной работе в форме опроса и теста.

4.Изучить термины по данной теме

Литература

1. Филиппович Ю.Б., Коничев А.С., Севостьянов Г.А., Кутузова Н.М. Биохимические основы жизнедеятельности человека. - М.: Владос, 2005. - 407 с.

2. Митякина Ю.А. Биохимия: учебное пособие. - М.: РИОР, 2005.- 113 с. (Электронный ресурс. - Режим доступа: http://www.knigafund.ru/books/28653).

3. Тестовый контроль знаний по биохимии: методическое пособие. – Ульян. гос. пед. ун-т им. И. Н. Ульянова. – Ульяновск: УлГПУ, 2010. - 28 с.