Применение ионизирующего излучения для радиационной стерилизации ветеринарных принадлежностей, бактерийных препаратов и для получения радиовакцин

В основе использования ионизирующих излучений для радиационной стерилизации в радиационно-биологических технологиях лежит радиочувствительность микроорганизмов и ее модификация.

При использовании ионизирующих излучений в РБТ обычно учитывают три радиобиологических явления:

1) радиочувствительность микроорганизмов;

2) причины и закономерности репродуктивной гибели микроорганизмов при облучении;

3)способы модификации (усиления) репродуктивной гибели микроорганизмов.

Под радиочувствительностью микроорганизмов понимается величина поглощенной дозы, вызывающая формирование определенного, количественно учитываемого радиобиологического эффекта. В качестве такого эффекта используют репродуктивную гибель организмов, т. е. потерю способности микроорганизма к размножению. При облучении популяции микроорганизмов определяют зависимость репродуктивной гибели от дозы облучения, строят кривую «доза-эффект», по ней находят дозу, при которой 37 % популяции остается неповрежденной (т. е. 63 % популяции погибает). Эту дозу называют средней летальной дозой. Чем больше величина средней летальной дозы, тем устойчивее микроорганизм к действию радиации. Радиочувствительность зависит от многих факторов. Однако РБТ базируется только на тех факторах, которые позволяют реально повысить радиочувствительность популяции микро-организмов. К этим факторам относят:

1) снижение активности ферментных систем репарации;

2) увеличение интенсивности деления клеток;

3) снижение уровня антиокислителей и накопление перекисных и хиноидных радиотоксинов;

4) снижение уровня эндогенных сульфгидрильных групп и биологических аминов;

5) перевод генома из состояния покоя в активное состояние.

При использовании ионизирующих излучений для стерилизации и обеззараживания не ставится задача полностью убить существующие в облучаемом объекте микроорганизмы, а только подавить их способность к неограниченному (бесконечному) размножению. Прекращение деления клетки (репродуктивная гибель) является результатом взаимодействия двух групп противоположно направленных процессов. В первую группу процессов, повышающих вероятность гибели клеток, входят следующие процессы: 1) нарушение структуры молекулы ДНК, процессов синтеза и восстановления ДНК;

2) изменение структуры и проницаемости биомембран;

3) образование внутри бактерий и в окружающей их среде токсически действующих на них веществ;

4) нарушение основных процессов метаболизма;

5) снижение деятельности макроэргов, устраняющих поврежденные белки и другие молекулы.

Во вторую группу процессов, снижающих вероятность гибели клеток, входят: 1) процессы репарации ДНК;

2) удаление поврежденных участков ДНК;

3) ликвидация брешей и воссоединение разрывов молекул ДНК;

4) восстановление поврежденных мембран;

5) удаление и нейтрализация токсических веществ;

6) усиление деятельности макроэргов.

Таким образом, репродуктивная гибель микроорганизмов, зависит не только от дозы облучения, но и от характера последующих процессов, которые развиваются во времени и, в свою очередь, зависят от состояния многочисленных структур и обменных процессов микробных клеток как в момент облучения, так и в пострадиационный период.

Величину стерилизующих доз можно значительно снизить путем одновременного или пострадиационного воздействия других физических и химических факторов. Для усиления репродуктивной гибели микроорганизмов используют температурный эффект, изменение рН среды во время облучения, кислородный эффект, сенсибилизирующий эффект.

Поглощение бактериями энергии излучения и первичные радиационно-химические процессы в них не зависят от температуры. Однако, ферментативные процессы, происходящие в клетках в дальнейшем, чувствительны к действию температуры. Большинство ферментов работают в интервале температур 30-40 ⁰С. Незначительное повышение температуры (на 10-15 ⁰С) снижает активность белковых ферментов, участвующих в процессах репарации, поэтому резко снижается общая устойчивость бактерий, на фоне которой ионизирующее излучение оказывает более сильное поражающее действие. При повышении температуры угнетается процесс окислительного фосфорилирования, что приводит к нарушению энергетических процессов и снижению активности макроэргов. В организме бактерий имеется много термоустойчивых ферментов, к которым относятся протеолитические и окислительные ферменты. Под действием облучения увеличивается выход протеолитических ферментов из лизосом клетки, а повышенная температура вызывает их активацию, поэтому усиливается распад внутриклеточных структур и возрастает гибель микроорганизмов. При облучении активируются и окислительные ферменты: пероксидазы, полифенолоксидазы и др., а небольшое повышение температуры приводит к усилению образования перекисей, хинонов и других радиотоксинов, усиливающих гибель клетки.

Установлено, что имеются две области температур, в которых изменение температуры значительно влияет на действие излучений и гибель бактерий. Первая область – это переход от температуры ниже нуля (замороженное состояние облучаемого объекта) к температурам выше нуля. Резкое повышение радиочувствительности бактерий в этом случае связано с добавлением к прямому действию излучения косвенного, т. е. действия продуктов радиолиза воды. Изменение температуры во второй области в интервале от 0 до 37 ⁰С не вызывает значительного поражающего эффекта. Повышение температуры выше 37 ⁰С на 10-15 ⁰С усиливает эффект действия более чем на порядок по причине усиления активации ферментов. За счет незначительного повышения температуры значительно снижается доза облучения (рис. 2) поэтому этот метод экономически выгодный для уничтожения патогенной флоры.

Рис. 2. Влияние температуры (20-минутный прогрев)

на радио­чувствительность стафилококка

Изменение рН среды во время облучения также влияет на радиочувствительность микроорганизмов по нескольким причинам. При смещении рН в кислый интервал, повышается повреждение ДНК. При изменении рН изменяется активность ферментов, изменяется степень влияния на ферменты активаторов и ингибиторов, что выводит клетку из нормального уравновешенного состояния и делает ее более чувствительной к действию экстримальных факторов, в том числе и к действию ионизирующих излучений. При облучении микроорганизмов сдвиг рН среды как в кислую сторону (рН = 4,6-2,2), так и в щелочную (рН = 10) повышает радиоустойчивость по сравнению с нейтральной средой (рН = 7).

Радиочувствительность бактерий значительно повышается при облучении в средах, содержащих кислород, при этом эффект достигается при сравнительно небольших концентрациях растворенного кислорода. Повышение содержания кислорода оказывает меньший эффект (рис. 3).

Основной вклад в реализацию кислородного эффекта вносят три процесса:

Первый процесс – значительное усиление косвенного действия продуктов радиолиза воды и многих низкомолекулярных органических соединений, образующих при облучении в присутствии кислорода биологически активные, токсически действующие вещества (перикись водорода, гидроперекисные соединения, фенолы, полифенолы), которые оказывают вторичное (косвенное) действие на геном клетки.

Рис. 3. Радиочувствительность У. colli B/r в зависимости

от крнцентрации кислорода.

Второй процесс – участие кислорода в модификации молекул при прямом действии излучения. При прямом действии ионизирующего излучения на ДНК происходит повреждение и появление свободного радикала тимина или С₃-дезоксирибозы, что в дальнейшем приводит к распаду тимина и разрыву углеводно-фосфатной связи ДНК. В отсутствии кислорода свободные радикалы тимина могут легко восстанавливаться до молекулы тимина. При наличии кислорода радикалы тимина реагируют с кислородом с образованием неустойчивой оксигидроперекиси тимина, что приводит к полному разрушению тимидинового кольца. Под влиянием радикалов водорода (Н⁰) или гидроксила (ОН⁰) возможно образование радикалов пиримидиновых оснований, взаимодействие которых с кислородом также приводит к образованию перекисей и разрушению молекул этих оснований. Поэтому образование одиночных разрывов в нити ДНК в присутствии кислорода происходит более интенсивно, что отражено на графике рисунка 4.

Рис. 4. Зависимость радиационно­го образования

одиночных разры­вов в ДНК от присутствия кисло­рода

Третий процесс – участие кислорода в повреждении молекул биомембран облученных бактерий. Известно, что ДНК любой клетки (в том числе и бактерий) связана с внутренней мембраной с образованием ДНК-мембранного комплекса. Начало синтеза молекулы ДНК происходит в точках ее прикрепления к мембране, на поверхности которой есть белковые рецепторы, различные липиды, имеющие ненасыщенные углеродные связи, различные ферменты и другие вещества. Поэтому при делении клеток большое значение имеет состояние мембраны, особенно целостность структуры молекул липидов и ферментов. Большинство липидов имеют повышенную радиочувствительность. При облучении бактерий в присутствии кислорода изменяется липидный состав биомембран, образуется значительно больше перекисей и продуктов их распада, поэтому нарушается синтез ДНК, прекращается деление клеток. Зависимость образования перекисей в биомембранах от присутствия кислорода показана на рисунке 5.

Рис. 5. Зависимость радиа­ционного

образования пероксидов в биомембранах

от при­сутствия кислорода

Ионизирующее излучение используют для радиационной стерилизации ветеринарных принадлежностей, бактерийных препаратов, питательных сред и получение радиовакцин.

Наиболее перспективно применение радиационной технологии при стерилизации наборов инструментов для искусственного осеменения животных, а также для стерилизации шовных и перевязочных материалов, хирургических инструментов, которые облучают дозой 25 кГр.

Для обеспечения стерильности сульфаниламидных препаратов и антибиотиков их облучают дозой 25 кГр, при этом не изменяются свойства и терапевтическая эффективность препаратов. При радиационной стерилизации гормоны и ферменты облучают дозой 60-70 кГр, витамины – 5-25 кГр, растворы различных препаратов для внутренних вливаний – 25 кГр.

Радиационную технологию используют для готовых вакцин бактериальных препаратов и питательных сред при культивировании микробов и вирусов, а также для получения новых препаратов – радиовакцин и радиоантигенов. Для приготовления радиовакцин против гриппа и паратифа достаточна доза 10 кГр, при этом сохраняются антивирусные свойства препарата, и не нарушается иммунитет животных.

Перспективным направлением является использование «живых» радиовакцин при гельминтозах, направленных на повышение иммунизации телят и ягнят путем заражения животных личинками гельминтов, облученных гамма-излучением в дозе 400-600 Гр. С помощью радиационных технологий готовят «убитые» вирусные и бактерийные вакцины против кишечных инфекций, когда они готовятся из убитых ионизирующим излучением компонентов.

Первой вирусной вакциной радиационной технологии была вакцина против бешенства. Для приготовления радиовакцины облучают стандартную взвесь бактерий вирусов в физиологическом растворе дозой 10-15кГр. Радиовакцины менее токсичны, обладают высокой иммуногенностью, по сравнению с эталонными вакцинами. Ионизирующие излучения используют для стерилизации вакцин в готовом и фасованном виде, где исключается возможность повторного обсеменения микроорганизмов при ампулировании и фасовании.