Определение размера эритроцита

Лабораторная работа 1

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗМЕРОВ ЭРИТРОЦИТОВ

С ПОМОЩЬЮ He-Ne ЛАЗЕРА

Приборы и принадлежности: источник излучения He-Ne лазер, матовый экран, дифракционная решетка, линейка, мазок крови.

Цель работы: изучить принцип работы лазера и его свойства. Рассчитать длину волны гелий-неонового лазера, с помощью явления дифракции света на дифракционной решетке. Определить размеры эритроцита в мазке крови при помощи явления дифракции.

Краткая теория

Устройство гелий-неонового лазера

Лазером называется устройство, генерирующее когерентные электромагнитные волны за счет вынужденного испускания света активной средой, находящейся в резонаторе.

Принципиальная схема лазера (рис. 1.1): активный элемент, помещенный между двумя взаимно параллельными зеркалами, и система накачки. Зеркала образуют так называемый оптический резонатор; одно из зеркал делают слегка прозрачным, сквозь это зеркало из резонатора выходит лазерный луч. Чтобы началась генерацию лазерного излучения, необходимо «накачать» активный элемент энергией от некоторого источника (его называют устройством накачки).

Рис. 1.1. Схема работы лазера

В гелий-неоновом лазере активным элементом служит смесь гелия и неона, заключенная в стеклянной трубке под низким давлением (рис.1.2). Энергия накачки подаётся от двух электродов с напряжением около 1000В. Резонатор такого лазера обычно состоит из двух зеркал - полностью непрозрачного с одной стороны трубки и второго, пропускающего через себя около 1 % падающего излучения на выходной стороне устройства.

Рис. 1.2. Схема гелий-неонового лазера

Устройство накачки вводит энергию в активный элемент (А) (рис. 1.3) - этот путь показан стрелками, например, с помощью газового разряда или импульса света.

Рис. 1.3. Схема спонтанного (самопроизвольного) (а) и

вынужденного (индуцированного) излучения (б) в двухуровневой системе: Е ₂ - энергия верхнего уровня, Е ₁ - нижнего, соотношение hv = Е ₂- Е ₁выполняется для всех квантов, изображенных на рисунке: а - спонтанное излучение кванта атомом, находящимся на верхнем энергетическом уровне (местонахождение электрона показано кружком); б - индуцированное излучение фотоном (1), действующим на возбужденный атом; 2 - тот же фотон после взаимодействия с атомом; 3 - фотон, излученный при электронном переходе; в - формирование «лавины» фотонов в активном элементе А в результате индуцированного излучения возбужденными атомами

Колебательной системой являются электронные перехо­ды между энергетическими уровнями атомов, ионов, молекул или полупроводников, из которых состоит активный элемент. Зеркала осуществляют положительную обратную связь.

Для получения излучения активного элемента необходимо перевести некоторое число атомов в возбужденное состояние. Для этой цели можно использовать газовый разряд. Полученное при разряде излучение будет монохроматическим. Однако при этом каждый атом излучает независимо, отдельные акты излучения происходят несогласованно (рис. 1.3а). В результате электромагнитные поля, излучаемые различными точками этого источника, некогерентны, т. е. имеют разные фазы, а излучение от этого источника распространяется во все стороны, как от обычной лампочки накаливания. Таким образом, существование только двух элементов из трех (рис. 1.3а) - источника энергии и колебательной системы - не позволяет получить когерентное излучение.

Для того чтобы получить такое излучение, должен быть задействован регулятор и обратная связь между атомами: излучение одного из них должно влиять на излучение других. При использовании явления индуцированного излучения это стало возможным. Вероятность перехода с верхнего энергетического уровня Е ₂ на нижний E ₁ возрастает, если на атом действует электромагнитное излучение, частота которого равна частоте, которая излучается при спонтанном переходе с верхнего уровня на нижний. Схематически это показано на рис. 1.3б. Если на атом до перехода действует фотон 1, то вследствие электронного перехода появляется новый фотон 3, при этом фотон 1 не изменился (его обозначим фотон 2). Особенность возникающего индуцированного излучения состоит в том, что фотон 3 имеет ту же частоту, направление поляризации и фазу, что и фотон 1, вызвавшый индуцированное излучение. Если в активном элементе А находится много возбужденных атомов, то проход одного фотона способен, в принципе, вызвать «лавину» фотонов вследствие индуцированного излучения (рис. 1.3в): при каждом взаимодействии фотона с возбужденным атомом вместо одного фотона возникает два одинаковых фотона.

Для увеличения вероятности излучения фотоны должны многократно проходить через активную среду. Для этого используют два зеркала З₁ и З₂ (рис. 1.1). Гелий-неоновый лазер испускает красный свет с длиной волны 632,8 нм. На рис. 1.4 приведена упрощенная схема возбужденных уровней энергии гелия и неона. Атомы гелия служат для преобразования энергии источника энергии в возбуждение атомов. Возбужденные атомы гелия находятся в метастабильном долгоживущем состоянии и при столкновениях передают энергию возбуждения атомам неона (горизонтальная волнистая стрелка). Переход, показанный наклонной прямой стрелкой, с верхнего возбужденного уровня атома неона на промежуточный и дает квант лазерного излучения с длиной волны 632,8 нм. Это излучение является индуцированным, его интенсивность определяют кванты этого излучения, существующие в лазере. Зеркала способствуют тому, что излучение за счет многократного прохода через активную среду осуществляет сильную положительную обратную связь, вызывая появление новых квантов излучения. Последующий переход атома неона в основное состояние (наклонная волнистая стрелка) не дает лазерного излучения.

Рис. 1.4. He-Ne лазер, упрощенная схема возбужденных уровней

энергии гелия и неона: прямая стрелка вверх - возбуждение гелия газовым разрядом, горизонтальная волнистая стрелка - безизлучательная передача энергии возбуждения от гелия к неону, наклонная стрелка - излучение атомами неона с длиной волны 632,8 нм, волнистая стрелка вниз - дальнейшая релаксация энергии с возбужденного уровня

Поскольку лазерное излучение обладает высокой когерентностью и монохроматичностью, можно считать, что лазер является источником плоской электромагнитной волны. С его помощью можно легко наблюдать явления, обусловленные волновой природой света, в частности, дифракцию. Дифракцией называют огибание волнами препятствий. Для ее наблюдения используется следующая схема (рис. 1.5а). Луч лазера освещает исследуемый объект (дифракционную решетку, мазок крови и т.п.). Дифракционную картину, состоящую из линейки ярких пятен, наблюдают на экране, расположенном перпендикулярно лазерному лучу на расстоянии L от объекта.

Рис. 1.5. Дифракция света

Схема наблюдений (а): Л - лазер; ДР - дифракционная решетка; Э - экран, стрелки показывают направления распространения дифрагированных лучей; x ₂, х _-2 - расстояния от нулевого дифракционного максимума до максимумов 2-го и -2-го порядков соответственно; схема формирования дифракционной картины с помощью дифракционной решетки (б): черное - непрозрачные участки; белое - прозрачные; d - период решетки

Дифракционная решетка представляет собой совокупность одинаковых параллельных непрозрачных полосок (штрихов), разделенных прозрачными полосками. Эта структура повторяется с периодом d - постоянной решетки (это малая величина порядка размеров клеток). При освещении решетки соседние прозрачные полоски становятся вторичными источниками света. Часть света просто проходит сквозь решетку по пути распространения лазерного луча и образует на экране яркий дифракционный максимум нулевого порядка. Излучение, испускаемое полосками почти по всем остальным направлениям, имеет разные сдвиги фазы и, суммируясь на экране, взаимно погашается, давая нуль. Однако по некоторым избранным направлениям излучение, испускаемое соседними полосками, имеет сдвиг фазы кратный 2π, т. е. равный целому числу волн.

Такое излучение складывается на экране, давая яркие пятна, а зависимость интенсивности от расстояния от центра пучка имеет резкие максимумы (рис. 1.6а).

Рис. 1.6. Интенсивность дифракционной картины,

создаваемой дифракционной решеткой (а) и мазком эритроцитов (б). Обе картины наблюдаются на экране, расположенном на расстоя­нии 30 см от решетки

Вывод основного уравнения дифракции очевиден из рис. 1.5. Разность хода лучей 1 и 2, d sin φ должна равняться целому числу длин волн т λ, где m =0; ±1; ±2 и т.д. - порядок дифракции, а именно: d sin φ = т λ. Так как угол φ мал, то вместо этого уравнения можно записать:

, (1.1)

где х_m - расстояние от центрального, нулевого максимума до максимума m -го порядка.

Если на пути световой волны от источника S вместо экрана с отверстием расположен круглый непрозрачный диск диаметра D, то для точки наблюдения на экране P, в зависимости от расстояния L, оказываются открытыми полуволновые зоны, начиная с некоторого m и до бесконечности. Легко показать, что такая постановка задачи приводит к парадоксальному выводу: независимо от значений D, L в центре тени диска должен наблюдаться максимум интенсивности (рис. 1.7).

Рис. 1.7. Изображение в центре тени диска максимума интенсивности

Действительно, суммарная амплитуда всех зон, начиная с некоторого номера m, должна начинаться в точке на спирали, соответствующей числу m, и оканчиваться в центре векторной диаграммы. Если вектор Ah определяет суммарную амплитуду, даваемую некоторым отверстием, то вектор Ad есть суммарная амплитуда волны, дифрагированной на диске того же диаметра. Сумма векторных амплитуд Ah и Ad во всех случаях отверстия и диска одного диаметра всегда равна амплитуде Ap волны, распространяющейся в отсутствие препятствия (принцип Бабине для дифракции на дополнительных экранах) (рис. 1.8).

Рис 1.8. Принцип Бабине для дифракции на дополнительных экранах

Тогда, независимо от числа перекрываемых диском полуволновых зон, векторная амплитуда в осевой точке оказывается конечной, монотонно возрастая по мере уменьшения диаметра диска. Это значит, что в центре его геометрической тени обязательно должен наблюдаться максимум интенсивности: ведь волны от краев идеально круглого диска в его центре всегда сфазированы.

Рис. 1.9. Наличие пятна Пуассона в центре тени диска произвольного диаметра при условии достаточной когерентности освещающей волны

Впервые на это обстоятельство обратил внимание академик Пуассон в 1818 г. Через некоторое время эксперименты Араго подтвердили наличие пятна Пуассона в центре тени диска произвольного диаметра при условии достаточной когерентности освещающей волны.

На приведенных фотографиях показаны реальные дифракционные распределения интенсивности световой волны за непрозрачными дисками различных диаметров. Отчетливо видно центральное пятно, интенсивность которого возрастает при уменьшении диаметра диска (рис. 1.9).

Дифракция на эритроцитах в мазке крови

В состав крови входят: плазма и форменные элементы (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты). Кровь на 46% состоит из форменных элементов. Эритроциты составляют 93% от них.

Эритроциты,красные кровяные тельца крови человека (рис.1.10). В организмеэ ритроциты переносят кислород от легких к тканям и двуокись углерода от тканей к легким; кроме того, регулируют кислотно-щелочное равновесие среды, абсорбируют из плазмы крови аминокислоты, липиды и переносят их ктканям. Зрелыеэ ритроциты млекопитающих животных и человека лишены ядра.

Рис. 1.10. Эритроциты

Характерным свойством эритроцитов является тенденция к образованию агрегатов. Условия образования агрегатов различны в крупных и мелких сосудах. Это связано в первую очередь с соотношением размеров сосуда, агрегата и эритроцита.

Здесь возможны варианты:

а) агрегаты эритроцитов («монетные столбики») в крупных сосудах;

Рис. 1.11Агрегаты эритроцитов

б) отдельные эритроциты в мелких артериях, артериолах;

Рис. 1.12.Отдельные эритроциты

в) деформация эритроцита в капилляре.

Рис. 1.13.Деформированные эритроциты

Нормальный эритроцит по своей форме похож на двояковогнутую линзу со средней толщиной около 2 мкм и диаметром около 8,5 мкм. В мазке крови на стекле он лежит, как плоский диск. Внутри эритроцит содержит белок гемоглобин, который сильно поглощает свет. Поэтому как оптический объект одиночный эритроцит в первом приближении представляет собой непрозрачный диск, размеры которого сопоставимы с длиной волны.

Рис. 1.14. Дифракционная картина эритроцитов

Соответствующая дифракционная картина имеет вид чередующихся светлых и темных концентрических колец с ярким пятном - нулевым максимумом в центре (рис. 1.14). Если число эритроцитов на мазке велико, и они расположены случайным образом друг относительно друга, то картина не изменяется.

Экспериментально точнее измерять не радиусы ярких колец, а радиусы r ₁, r ₂ тёмных колец. Как показывают результаты точного решения, соответствующие им углы дифракции определяются формулами:

; (1.2)

для соответственно 1-го и 2-го минимумов, где D - диаметр эритроцитов. Синус соответствующего угла дифракции вычисляется по формуле

,

где L - расстояние от образца до экрана.

Порядок выполнения работы

1. Включите He-Ne лазер в сеть переменного тока.

2. Установите дифракционную решетку на оптической ска­мье перпендикулярно лазерному лучу. На расстоянии L от решетки расположите экран. Измерьте это расстояние точно.

3. Зарисуйте наблюдаемую дифракционную картину.

4. Измерьте расстояния х_m от нулевого максимума до максимумов m -го и -m -го порядков по три раза для каждого максимума. Найдите средние расстояния и , а также среднее расстояние до максимумов ± m порядков. С помощью формулы (1.1), приняв d = 0,01 мм, найдите длину волны λ лазерного излучения для всех рассчитанных значений Х_m. Результаты измерений и вычислений запишите в таблицу.

Порядок максимумов, m	Расстояние до максимумов, среднее расстояние	sin φ m	Длина волны λ, нм
x-m ср, мм	xm ср, мм	xm, мм

Определение размера эритроцита

Установите на штативе вместо дифракционной решетки стекло с мазком крови. Перемещая образец в плоскости, перпендикулярной лазерному лучу, найдите место на краю мазка, для которого получается наиболее четкая дифракционная картина из светлых и темных колец - чередующихся максимумов и минимумов различных порядков.

Измерьте радиусы середин темных колец. Расчет размера эритроцита производится по формулам (1.2). Использовать дли­ну волны лазерного излучения, полученную в задании 1.

Если виден максимум только первого порядка, то надо трижды определить радиус кольца в разных направлениях и рассчитать три значения диаметра эритроцита.

где L =1,2,3.

Оценка погрешности при определении размеров эритроцитов.

Среднее значение диаметра подсчитывается по формуле

Среднеквадратическая ошибка данного измерения

Доверительный интервал среднего арифметического измеряемой величины рассчитывается по формуле

где t_n,p =4,3 - коэффициент Стьюдента для n =3 и доверительной вероятности р =0,95.

Окончательный результат записывается в виде:

Относительная погрешность:

Контрольные вопросы и задания

1. Объясните принцип работы лазера.

2. Перечислите и объясните основные характеристики лазерного излучения.

3. Дайте определение дифракции света.

4. Объясните процесс дифракции на эритроцитах в мазке крови.

5. Чем обусловлены различия дифракционной картины, создаваемой при дифракции лазерного излучения на дифракционной решетке, и дифракции на эритроцитах?