Ингибиторы матричных биосинтезов

Прекращение матричных биосинтезов ведет к гибели клетки. На этом основано применение антибиотиков (АБ), веществ, продуцируемых микроскопическими грибами, для лечения инфекционных болезней и злокачественных опухолей. АБ, взаимодействующие с ДНК, нарушают ее матричную функцию и подавляют репликацию или транскрипцию. Их применяют для лечения опухолей. Противоопухолевые АБ не отличаются избирательностью, т.е. практически взаимодействуют с ДНК как опухолевых, так и нормальных клеток. Поэтому при лечении могут повреждаться здоровые клетки, что требует хорошо поставленного контроля при использовании противоопухолевых АБ.

АБ, взаимодействующие с белками рибосом, ингибируют трансляцию. Они применяются в основном как противобактериальные средства, отличаются достаточно высокой избирательностью и часто сравнительно мало токсичны для человека. Это объясняется различиями в строении белков рибосом и бактерий человека.

Интерфероны

- группа белков, регулирующих реакцию клетки на вирусную инфекцию. Синтез интерферонов индуцируется некоторыми компонентами вирусных частиц, в частности двуспиральной РНК, имеющейся во многих вирусах. Интерферон в свою очередь индуцирует синтез фермента протеинкиназы, которая катализирует фосфорилирование фактора инициации IF₂:

IF₂ + АТФ ® IF₂ -ОРО₃Н₂ + АДФ

В результате фактор инициации утрачивает активность, и синтез белков в клетке прекращается. Кроме того, интерферон активирует латентную РНКазу (механизм активации последней связан с активацией под влиянием интерферонов 2’,5’-олиго(А)-синтазы и накоплением в клетке 2’,5’-олиго(А)), которая расщепляет матричные и рибосомные РНК. Конечно, это ведет к гибели клетки, но вместе с ней погибают и вирионы.

Ингибирование синтеза белков дифтерийным токсином

Возбудитель дифтерии, размножающийся в слизистой зева, выделяет токсин белковой природы. Этот белок, состоящий из одной полипептидной цепи с мол. массой ~ 60000, поступает в клетку, где под действием протеиназ клеток хозяина распадается на два фрагмента: А и В. Фрагмент А представляет собой фермент АДФ-рибозилтрансферазу, переносящий АДФ-рибозильный остаток с НАД⁺ на фактор элонгации ЕF₂:

НАД⁺ + EF₂ ® АДФ-рибозил-EF₂ + никотинамид

Модифицированный таким образом фактор элонгации утрачивает способность участвовать в регенерации EF₁ и трансляция прекращается. Этим объясняется токсическое действие белка. Фрагмент В не обладает ферментативной активностью, не токсичен. Он необходим для проведения фрагмента А через клеточную мембрану внутрь клетки.

С действием токсина связаны все основные симптомы дифтерии. Размножающиеся бациллы выделяют токсин, вследствие чего клетки слизистой зева погибают, и развивается воспалительная реакция. Из лейкоцитов, экссудата и погибших клеток образуется пленка, которая может стать причиной асфиксии, наиболее опасного осложнения дифтерии. Кроме того, дифтерийный токсин вызывает поражение сердца, что является частым осложнением заболевания.

Молекулярные механизмы генетической изменчивости

Естественный отбор и биологическая эволюция невозможны без генетической изменчивости, которая возникает за счет мутаций и рекомбинаций в процессе мейоза. В последнем случае происходит обмен участками ДНК между гомологичными хромосомами родителей.

С изменчивостью связаны такие явления как гетерогенность популяций человека и существование наследственных болезней.

Генные мутации

Мутации – это нерепарированные изменения первичной структуры ДНК, появляющиеся в молекуле в ответ на дефекты в работе ДНК-полимераз или ДНК-репарирующих систем, воздействия внешней и внутренней среды.

Точечные мутации (затрагивающие один нуклеотид ДНК) в основном бывают трех видов: замены (это наиболее распространенный тип повреждений молекулы ДНК), вставки и делеции (или выпадения) нуклеотидов.

Каждый тип мутации вызывает разные последствия: так, замена нуклеотида а) может быть “молчащей” и не проявиться в белке, если кодирующий триплет, в котором находится мутантный нуклеотид, из-за вырожденности кода обеспечивает включение в белок той же аминокислоты, что исходный кодон; б) может сопровождаться включением в белок одной измененной аминокислоты (миссенс-мутация). Так возникла, например, мутация, проявляющаяся как серповидно-клеточная анемия: кодон, ответственный за включение Glu в положение 6 b-цепи гемоглобина, превратился в кодон Val; в) если в результате замены образуется один из терминирующих кодонов – UAA, UAG или UGA (нонсенс-мутация), то синтез пептидной цепи обрывается и получается укороченный вариант белка.

Делеции и вставки также приводят к неоднозначным результатам: а) если включается или выпадает один нуклеотид или участок ДНК, в котором число нуклеотидов не кратно трем, то происходит сдвиг рамки считывания информации и при трансляции вся информация, расположенная за местом мутации, считывается неверно. В результате такой мутации синтезируется белок с бессмысленной последовательностью аминокислот. Такого типа мутации вызывают вещества, интеркалирующие (встраивающиеся) между азотистыми основаниями молекулами ДНК; б) если выпадает или включается в ДНК участок с длиной цепи, кратной 3, то сдвига рамки не происходит (делеция или вставка без сдвига рамки считывания информации). Белок, который зашифрован такой мутацией, будет либо укорочен (при делеции), либо удлинен (при вставке) на одну или несколько аминокислот.

В большинстве случаев мутации влияют на экспрессию или структуру генов, что проявляется в снижении количества или изменении структуры белкового продукта, а, следовательно, и его функциональной активности. Иногда снижение ил полное отсутствие белка является результатом мутаций в регуляторных участках генов.

Мутации в половых клетках передаются по наследству и могут проявляться в фенотипе потомства как наследственная болезнь, связанная со структурным или функциональным изменением белка. В соматических клетках мутации могут вызвать различные функциональные нарушения, такие как непереносимость некоторых пищевых и лекарственных веществ, предрасположенность к определенным заболеваниям, а иногда трансформацию клеток и развитие опухолей.

Полиморфизм белков

У разных особей возникают варианты (мутации) разных генов или варианты одного и того же гена. Варианты генов, образующиеся у отдельных особей, могут постепенно распространяться в популяции в результате наследования, если они не летальны. Так формируется генотипическая неоднородность популяции, которая ведет и к фенотипической неоднородности. На молекулярном уровне наиболее изучен (как следствие генотипической гетерогенности) полиморфизм белков – существование разных форм белка, выполняющего одинаковые или очень сходные функции (изобелки).

Причинами, приводящими к образованию изобелков, являются: 1) мутации; 2) рекомбинации. Гомологичные хромосомы половых клеток в процессе мейоза могут обмениваться аллелями или их частями. Если при рекомбинации аллельные гены обмениваются не целиком, а участками меньшей длины, то такой обмен будет приводить к появлению новых, прежде не существовавших в популяции аллелей (а не просто новых сочетаний прежних аллелей). Рекомбинации – гораздо более частые события, чем мутации, поэтому разнообразие форм внутри вида обусловлено главным образом именно рекомбинациями; 3) амплификация генов. При дихотомической эволюции происходит удвоение генов, т.е. образуются новые генные локусы: сначала это копии исходного гена, но последующие мутации копий приводят к появлению в организме изобелков. В этом случае варианты белка являются продуктами разных генных локусов, а не аллельных генов.

Т.о., изобелки – это множественные молекулярные формы белка, обнаруживаемые в пределах организмов одного биологического вида, как результат наличия в генотипе вида множественных аллелей или множественных генных локусов.

Примеры полиморфизма белков. Гемоглобин

Гемоглобины А (a₂b₂), А₂ (a₂d₂), F (a₂g₂) содержатся в эритроцитах всех людей. Гены этих белков не аллельны – они занимают разные локусы. Эти гены возникли в результате дупликации гена-предшественника и последующих независимых мутаций. Но в крови некоторых людей обнаруживаются гемоглобины, являющиеся продуктами аллельных генов. Один из вариантов – это HbS. По аллелям HbA и HbS все люди делятся на три группы с генотипами AA, AS и SS. У людей первой группы эритроциты содержат HbA, у второй – HbA и HbS, у третьей – HbS. Распространенность аллеля S – людей с генотипами AS и SS – географически неравномерна: у некоторых народностей Азии и Африки – до 35%, тогда как у европейцев встречается редко.

Существует еще один вариант гемоглобина: Hb C (β₆Glu→Lys). По этой паре аллелей существуют генотипы АА, АС и СС. Теперь всех людей можно разделить на пять генотипически и фенотипически разных групп: AA, AS, SS, АС, СС. Известно около 300 аллельных вариантов гемоглобина А. Следовательно, по всем аллелям HbA люди образуют около 600 генотипически различающихся групп.

Группы крови

Групповая принадлежность крови определяется системой АВО, имеющей важное значение для практики переливания крови.

Интегральный гликопротеин глифорин присутствует только в плазматической мембране эритроцитов. К N-концевой части белка, расположенной на наружной поверхности мембраны, прикреплено около 20 олигосахаридных цепей. Олигосахариды гликофорина – антигенные детерминанты системы групп крови АВО.

У созревающих эритроцитов этот олигосахарид имеет последовательность: фукоза - галактоза – N-ацетилглюкозамин – R. Олигосахарид ковалентно связан с липидами мембраны. При созревании эритроцита олигосахарид удлиняется на один моносахаридный остаток. Присоединение моносахарида к галактозе катализирует фермент гликозилтрансфераза. В популяции человека встречаются три аллельных гена этого фермента (А, В и О) и соответственно три аллельных варианта фермента, которые обозначаются теми же буквами. Варианты фермента А и В различаются по субстратной специфичности: вариант А присоединяет к олигосахариду N-ацетилгалактозу, а вариант В – галактозу. Аллельный ген О кодирует синтез белка, не имеющего ферментативной активности. Т.о. разные аллели обусловливают образование гликозилтрансфераз, катализирующие процессы:

аллель А ® фермент А ® олигосахарид А

аллель В ® фермент В ® олигосахарид В

аллель О ® неактивный белок ® олигосахарид не достроен.

Разветвленные олигосахариды А и В являются антигенами. К каждому из них могут вырабатываться антитела. При смешивании раствора анти-А с кровью, эритроциты которой содержат антиген А, происходит агглютинация эритроцитов. То же происходит при встрече анти-В с эритроцитами, содержащими антиген В. Поэтому при переливании крови руководствуются правилом: кровь донора и реципиента не должна содержать антиген и антитело, реагирующие между собой, иначе произойдет агглютинация эритроцитов и гемолиз.

Биохимическая индивидуальность

В настоящее время известны десятки белков, для которых найдены множественные формы. Есть основания считать, что у значительной части из десятков тысяч структурных локусов генома человека имеются аллели. А это значит, что число разных генотипов может быть практически неисчерпаемым.

Полиморфизм белков и других биохимических структур настолько велик, что можно говорить о биохимической индивидуальности. С биохимической индивидуальностью связаны и индивидуальные особенности развития и здоровья.

Использование ДНК-технологий в медицине

Получение рекомбинантных ДНК.

Получение гена или его фрагмента осуществляется, как правило, с использованием рестриктаз – ферментов из группы эндонуклеаз, “узнающих” определенную последовательность нуклеотидов ДНК и расщепляющих обе нити. Расщепление обеих нитей ДНК может происходить двояким путем с образованием двухцепочечных (“слепых”) или одноцепочечных (“липких”) концов.

Ген или его фрагмент, имеющий “липкий” конец, может по принципу комплементарности взаимодействовать с “липким” концом другого, не родственного ему фрагмента ДНК, полученного при действии на ДНК одной и той же рестриктазы. Фрагменты ковалентно соединяют друг с другом с помощью ДНК-лигазы и получают рекомбинантные (гибридные) ДНК. Далее, с помощью вектора, обычно ретровируса, чужеродный ген вводится в бактерию, и здесь обеспечивается репликация, транскрипция и трансляция с образованием нужного продукта.

С помощью техники рекомбинантных ДНК оказалось возможным: а) использовать микроорганизмы в качестве продуцентов веществ, необходимых для человека (инсулин, гормон роста, VIII фактор свертывания крови для лечения гемофилии); б) лечить наследственные и ненаследственные (инфекционные) заболевания путем введения генов в клетки пациентов для устранения дефектов генов или придания им новых функций. Впервые эта задача была успешно решена в 1990 году, когда 4-летней девочке, страдающей наследственным иммунодефицитом, вызванным мутацией в гене аденозиндезаминазы, были пересажены ее собственные лимфоциты, предварительно трансформированные вне организма рекомбинантной ДНК, содержащей ген аденозиндезаминазы и ретровирусный вектор. В настоящее время предпринимаются попытки лечения подобным способом некоторых наследственных заболеваний, а также ВИЧ-инфекции.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

- метод получения большого числа копий (несколько миллионов) гена или его фрагмента за короткий период времени в условиях репликации in vitro, требующий очень малых количеств исходной ДНК в образце. Объектами для выделения ДНК могут быть кровь, раневое отделяемое и т.д. Метод широко используется, в частности, в микробиологии для тестирования инфекционных возбудителей.