Главная Случайная страница Контакты | Мы поможем в написании вашей работы! | ||
|
3. Индукция мутаций под действием ультрафиолетового (УФ) облучения (демонстрация). Объект облучают при красном свете бактерицидной лампой ВУФ-15 на расстоянии 60 см от его центра.
Предварительно определяют бактерицидную дозу УФ-облучения, устанавливая оптимальную мутагенную дозу (0,1—1 % от числа выживших бактерий).
Для получения lac-мутантов Е.coli испытуемую культуру, содержащую 2х 108 бактерий в 1 мл среды, выращивают в питательном бульоне в течение 14—18 ч. Бактерии осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 40 мл 0,1 моль 1 л раствора MgSО4 и охлаждают во льду (для прекращения деления клеток). Затем суспензию в объеме 50 мл помещают в стерильную чашку Петри и облучают в течение 15—150 сек., после чего клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в таком же объеме питательного бульона и инкубируют при 37 °С в течение 14—18 часов. Затем из разведения 102—105 по 0,1 мл высевают на плотную селективную питательную среду (среда Эндо) в чашки Петри и растирают шпателем.
Для выделения антибиотикорезистентных мутантов используют штамм E.coli В или К12, который высевают после облучения на минимальный агар с определенной концентрацией антибиотика. Например, ампициллин—10 мкг/мл, левомицетин— 5 мкг/мл, пенициллин — 100 мкг/мл.
На среде Эндо lac-мутанты Е. coli образуют бесцветные колонии. Клетки Е. coli, выросшие на среде с указанной концентрацией антибиотика, являются к нему резистентными. Параллельно делают контрольные посевы.
4. Опыт трансформации (демонстрация). Реципиентом является стрептомициночувствительный штамм сенной палочки - Escherichia coli Strs, донором - ДНК, выделенная из штамма Escherichia coli Strr , устойчивого к стрептомицину. Селективной средой для отбора рекомбинантов служит питательный агар со стрептомицином (100 ЕД/мл).
К 1 мл бульонной культуры В. subtilis добавляют 1 мкг/мл ДНК донора, смесь инкубируют при 37 °С в течение 30 мин, после чего в пробирку вносят смесь 0,1 мг/мл раствора ДНКазы (для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиентного штамма), и вновь инкубируют в течение 5 мин. Для определения количества образовавшихся стрептомицинустойчивых рекомбинантов 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Для определения количества клеток реципиентной культуры готовят ее десятикратные разведения в изотоническом растворе хлорида натрия до 10–5 – 10-6 (для получения сосчитываемого количества колоний), высевают по 0,1 мл на питательный агар без стрептомицина, а для контроля - на агар со стрептомицином. Посев инкубируют при 37 °С. На следующий день учитывают результаты опыта и определяют частоту трансформации по отношению количества выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма. На среде со стрептомицином реципиентная культура не должна расти, т.к. она чувствительна к стрептомицину. Частота трансформации определяется отношением количества выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма .
5. Опыт специфической трансдукции (демонстрация). Реципиентом является штамм Е. coli lac-, лишенный β-галактозидазного оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг—фаг λ dgal, часть генов которого замещена дефектным β -галактозидазным опероном Е. сoli, неспособным вызывать лизис кишечной палочки. На селективной среда Эндо лактозоотрицательные колонии бактерий реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозоположительные колонии рекомбинантного - красные колонии с металлическим блеском.
К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага λ dgal (концентрация 106—107 бактерий в 1 мл). Смесь инкубируют при 37 °С в течение 60 мин, затем готовят ряд десятикратных разведении. Из пробирки с разведением 106 делают высев по 0,1 мл культуры на три чашки Петри со средой Эндо и равномерно распределяют жидкость шпателем по поверхности среды. Посевы инкубируют в течение суток, после чего отмечают результаты опыта и вычисляют величину трансдукции по отношению количества клеток рекомбинантов (трансдуктантов), обнаруженных на всех чашках, к числу клеток реципиентного штамма.Частота трансдукции определяется отношением числа клеток рекомбинантов к числу клеток реципиентного штамма.
6. Опыт конъюгации с целью передачи фрагмента хромосомы, содержащего ген leu, контролирующего синтез лейцина (демонстрация). Донор — штамм Е. coli K12 Hfr leu+ Strs. Реципиент—штамм E. coli K12F- leu- Strr. Селективная среда для выделения рекомбинантов — минимальная глюкозосолевая среда со стрептомицином. К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют I мл бульонной культуры донора. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 30 мин, затем смесь разводят до 10–2 - 10-3 и высевают по 0,1 мл на селективную агаровую среду в чашки Петри, на которой вырастут только колонии рекомбинантов. В качестве контроля на ту же среду высевают штаммы донора и реципиента, которые не будут расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрептомицину, а второй ауксотрофен по лейцину. Культуру донорского штамма высевают также на селективную среду без стрептомицина, а культуру реципиентного штамма—на полную среду (питательный агар с антибиотиками) для определения числа жизнеспособных клеток. Посевы инкубируют доследующего дня при 37 °С. После подсчета числа выросших колоний определяют частоту рекомбинаций по отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным.
7. Определение Col-плазмид (колициногенных факторов - демонстрация). Исследуемые культуры Е.coli засевают методом укола в питательный агар в чашке Петри (по 7—8 уколов на 1 чашку). Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток, после чего на внутреннюю поверхность чашки помещают кусочек ваты, смоченный хлороформом, в парах которого погибают бактерии. Затем по поверхности агара равномерно распределяют 3 мл расплавленного и остуженного до 450 С полужидкого (0,7 %) питательного агара, смешанного с 0,1 мл 4-часовой бульонной индикаторной культуры. Через 18—24 ч инкубации посевов при 370 С учитывают результаты опыта. Вокруг посевов исследуемых культур, продуцирующих колицины, появляются прозрачные зоны подавления роста индикаторного штамма бактерий.
8. Определение колицинотипа (демонстрация). В питательный агар в чашки, Петри методом укола засевают эталонные штаммы бактерий с известным колициногенотипом. Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток, после чего бактерии убивают парами хлороформа. Затем по поверхности агара равномерно распределяют 3 мл расплавленного и остуженного полужидкого агара, смешанного с 0,1 мл 4-часовой бульонной культуры Е. coli неизвестного колициногенотипа (например. Col A, Col В и др.). Результаты опыта учитывают через 18—24 ч, отмечая наличие или отсутствие роста. Исследуемая и индикаторная культуры имеют один и тот же колициногенотип, т. е. содержат идентичные Col-плазмиды. При несовпадении колициногенотипа вокруг эталонных штаммов появляются зоны задержки роста бактерий.
Молекулярно-генетические методы идентификации микроорганизмов основываются на анализе нуклеиновых кислот микроорганизмов.
1. Рестрикционный анализ. Сущность метода заключается в обработке ДНК рестрикционными ферментами (специфическими эндонуклеазами), разрезающими молекулу ДНК по определенным последовательностям нуклеотидов. После этого анализируют полученные фрагменты, специфические для каждого вида или варианта микроорганизма.
2. Гибридизация ДНК. Метод основан на определении уникальных последовательностей генома микроорганизма, отражающих свойства вида или варианта. Сущность обнаружения таких участков ДНК основана на способности комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот к гибридизации. Исследование проводят с помощью меченых ферментом, радионуклидом или флюорохромом нуклеиновых зондов, представляющих однонитевые фрагменты ДНК, комплементарные уникальным участкам микробного генома. Основной областью применения является идентификация трудно культивируемых или медленно растущих микробов (например, представителей родов Mycobacterium, Neisseria, Campylobacter). Метод молекулярной гибридизации требует большого количества молекулярных зондов, времени, сложен в постановке, не отличается высокой чувствительностью и широкого практического применения не нашел.
Самостоятельная работа студентов сводится к учету демонстрационной реакции гибридизации, поставленной при хламидиозе.
3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод ПЦР позволяет обнаруживать уникальные (специфические) участки ДНК, находящиеся в исследуемом образце в очень малых количествах. Сущность ПЦР основана на амплификации (увеличении) числа копий искомого участка генома микроорганизма, причем для идентификации вида микроорганизма теоретически достаточно одной копии искомой уникальной последовательности.
С этой целью образец инкубируют в буферном растворе с двумя короткими ДНК-олигомерами (праймерами), комплементарными концам известного уникального фрагмента генома, термостабильной ДНК-полимеразой и нуклеотидами. После гибридизации олигомеров с комплементарными участками ДНК они служат праймерами для полимеразы, которая копирует искомый фрагмент. Образец многократно (20-40 раз) нагревают для разделения цепей двойной спирали ДНК и охлаждают для повторной гибридизации праймеров с комплементарной матрицей, при этом каждая копия участка ДНК становится новой матрицей для синтеза следующей копии. Количество копий искомого фрагмента генома в результате амплификации увеличивается экспоненциально. Амплификация в миллионы раз занимает всего несколько часов.
ПЦР широко используется в диагностических целях. Достоинства ПЦР как метода диагностики инфекционные заболеваний заключаются в следующем:
1. ПЦР дает прямые указания на присутствие возбудителя в исследуемом материале без выделения чистой культуры.
2. Метод обладает очень высокой чувствительностью (от нескольких до одного возбудителя в пробе) и 100% специфичностью. Количество исследуемого материала может составлять несколько десятков микролитров.
3. Исследуемый материал может быть дезинфицирован с помощью химических или термических методов, что исключает инфицирование персонала в процессе проведения ПЦР.
4. Простота исполнения, возможность полной автоматизации, быстрота получения результатов (4-5 часов) позволяет отнести ПЦР к экспресс-методам диагностики.
Студенты производят учет демонстрационной ПЦР, поставленной при уреаплазмозе (рис. 12).
Дата публикования: 2015-10-09; Прочитано: 620 | Нарушение авторского права страницы | Мы поможем в написании вашей работы!