Стр. 163

Рис. 6-16

Надписи на рисунке:

A

B

1 — Токи одиночного Cl^–-канала

2 — График I-V одиночного Cl^–-канала

3 — мВ

4 — время (мс)

5 — наклон кривой(проводимость)=30пС Ы Научному редактору! Уточните перевод slope Переводчик Ы

6 — пА

=============================

Одиночные каналы могут переходить от открытого к закрытому состоянию и обратно

Когда канал перешел из закрытого состояния (нулевой ток) к своей полной одиночной проводимости, говорят, что канал находится в открытом состоянии. Открытие-закрытиеканала, таким образом, представляет собой переход между закрытым и открытым состоянием. Регистрация токов через одиночный канал служит фактически отражением конформационных изменений одиночной белковой молекулы канала, показывает продолжительность открытого состояния молекулы и ее закрытого состояния.

Анализ последовательных записей регистрации микроучастка, таких как на рис. 6-15 A, показывает, что открытие-закрытие одиночного канала — вероятностный процесс. В среднем есть определённая вероятность, что канал откроется в любой момент времени, но такие открытия происходят беспорядочно. К примеру, усредняя запись на рис. 6-15 Б свидетельствует, что вероятность того, что каналы откроются максимальна примрно спустя 4 мс после начала деполяризации.

Процесс открытия-закрытия канала может быть представлен кинетическими моделями, которые подобны следующей гипотетической двухстадийной схеме:

Ы Верстка! Вставить формулу 6-20 стр. 164 РД Ы

(6-20)

Эта схема указывает, что канал может обратимо изменять свою конформацию между закрытым (C) и открытым (O) состояниями, согласно реакциям первого порядка, которые определены постоянным коэффициентом открытия (k_о) и постоянным коэффициентом закрытия (k_c). Вероятность открытия канала (P_o) —доля всего времени существования канала, в течение которого канал находится в открытом состоянии.

Мы уже видели на рис. 6-15, что средняя величина многих записей активности одиночного канала от данного микроучастка демонстрирует временной ход тока, который подобен макроскопическому (интегральному) току, зарегистрированному от той же самой клетки. Это же верно и для суммы отдельных записей токов от одиночного канала. Это заключение ведет к важному принципу: макроскопический ионный ток равен произведению числа каналов (N) на единицу площади мембраны на ток одиночных каналов и вероятность открытия канала:

Ы Верстка! Вставить формулу 6-21 стр. 164 РД Ы

(6-21)

Сравнение величины макроскопических токов, зарегистрированных от больших областей потенциал-фиксированной мембраны, с величиной тока одиночного канала, измеренного пэтч-методами, указывает, что плотность ионных каналов на поверхности клетки обычно находится в пределах от 1 до 1000 каналов на 1 мкм² клеточной мембраны — в зависимости от канала и типа клетки.

Молекулярная физиология ионных каналов

Классы ионных каналов можно различить на основе электрофизиологии, фармакологических и физиологических лигандов, внутриклеточных посредников и гомологичных последовательностей

Клетки млекопитающих обладают множеством ионных каналов. Один из способов осознать это разнообразие состоит в том, чтобы классифицировать каналы согласно их функциональным характеристикам. Среди этих характеристик — электрофизиологическое поведение, ингибирование или стимуляция различными фармакологическими агентами, активация внеклеточными агонистами и модуляция внутриклеточными регуляторными молекулами. Кроме того, можно классифицировать каналы в соответствии с их структурными особенностями, такими как аминокислотные гомологичные последовательности и виды субъединиц, из которых они составлены.

Электрофизиология. Этот подход состоит из анализа ионных токов методами фиксации потенциала и характеристики каналов на основе ионной селективности, зависимости открытия от мембранного потенциала и расчета кинетик перехода в открытое и закрытое состояние.

Одно из самых поразительных различий среди каналов — их селективность для различных ионов. Действительно, каналы вообще называют согласно тому иону, для которого они наиболее проницаемы, например Na⁺-каналы, Ca²⁺-каналы, K⁺-каналы, и Сl^–-каналы.

Другая главная электрофизиологическая особенность каналов — их зависимость от потенциала. В электрически легковозбудимых клетках и органах (таких, например, как нерв, скелетная мышца, сердце) главный класс каналов становится активированным (и часто инактивированным), как крутая функция V_m. К примеру, Na⁺-канал в нервных и мышечных клетках все более и более активируется, когда V_m становится более положительным (см. главу 7). Такие потенциал-управляемые каналы обычно высокоизбирательны для Na⁺, Ca²⁺ или K⁺.

Каналы также отличает кинетика поведения воротного механизма. К примеру, два воображаемых канала, каждый с вероятностью открытого состояния (P_o), составляющей 0,5. Один канал мог бы открываться и закрываться в среднем с продолжительностью 1 с, тогда как другой может иметь ту же самую P_o открытия и закрытия в среднем 1 мс. Сложные паттерны открытия-закрытия некоторых каналов характеризуются многократным коротковременным открытием нескольких каналов, после чего следует более длительный период «затишья».

Фармакологические лиганды. Токи, которые фактически неразличимы по электрофизиологическим критериям, можно иногда различать фармакологически. Так, подтипы потенциал-зависимых Na⁺-каналов можно различить по их чувствительности к пептидному токсину µ-конотоксину), который синтезирует улитка Conus geographus — член семейства ядовитых морских моллюсков под названием Cone. Этот токсин сильно ингибирует Na⁺-каналы взрослой скелетной мышцы крысы, но оказывает слабый эффект на Na⁺-каналы нейронов и сердечных миоцитов. Другой конотоксин (ω-конотоксин) от другой улитки специфически ингибирует потенциал-зависимые Ca²⁺-каналы в спинном мозге. Синтетический аналог этого конотоксина —зиконотид ^Ã, его применяют для лечения невропатических болей.

Физиологические лиганды. Некоторые каналы характеризуются своей уникальной способностью активироваться при связывании специфической молекулы, называемой агонистом. Так, каналы, встроенные в постсинаптическую мембрану нервно-мышечных синапсов позвоночных, названные никотиновыми ацетилхолиновыми (АХ) рецепторами, открываются в ответ на связывание АХ, высвобождаемого из пресинаптического нервного окончания, а также в ответ на действие агониста - никотина. Другие агонист-зависимые каналы активируются непосредственно нейротрансмиттерами, такими как глутамат, серотонин (5-гидрокситриптамин [5-HT]), g-аминомасляная кислота (ГАМК) и глицин.

Внутриклеточные посредники. Каналы можно классифицировать по их физиологической регуляции внутриклеточными посредниками. К примеру, увеличение [Ca²⁺]_i стимулирует некоторые ионные токи, в частности K⁺- и Сl^–-токи. Каналы, пропускающие такие токи, известны как Ca²⁺-зависимые K⁺-каналы и Ca²⁺-зависимые Сl^–-каналы, соответственно. Другой пример замечен в плазматической мембране светочувствительных клеток - палочек сетчатки, в которых специфический тип канала непосредственно активируется внутриклеточным циклическим гуанозинмонофосфатом.

Четыре функциональных критерия — электрофизиология, фармакология, внеклеточные агонисты и внутриклеточные регуляторы — не исключают друг друга при характеристике каналов. К примеру, один из основных типов Ca²⁺-активированных K⁺-каналов является также потенциал-зависимым.

Гомология последовательностей. Разнообразие каналов с вытекающими функциональными критериями в конечном счете требует молекулярно-биологической классификации. Такой подход начался в 1970–1980-х годах с биохимической очистки канальных белков. Мембранные биохимики первоначально использовали богатые естественные источники ионных каналов, такие как электрические органы ската и угря Electrophorus, чтобы изолировать канальные белки, такие как никотиновый АХ-рецептор (см. главу 8) и потенциал-зависимый Na⁺-канал, соответственно. Аминокислотное секвенирование очищенных канальных белков предоставило информацию, необходимую для подготовки олигонуклеотидных проб для выделения кодирующих последовательностей каналов из клонов кДНК, в свою очередь полученных от мРНК. Таким образом были клонированы гены, кодирующие многие типы белков различных ионных каналов. Эта работа подтвердила, что разнообразие каналов, предвещаемых физиологическим анализом, соответствует их огромному разнообразию на молекулярном уровне.

Когда создание базы человеческого генома будет закончено, дефинитивный каталог значений ионных каналов для медицинской физиологии станет доступен. На основе банка данных «Белковые последовательности каналов млекопитающих» мы распознаем, по крайней мере, 24 различных семейства канальных белков (табл. 6-2). Несмотря на быстрый прогресс в клонировании каналов, детализированное представление трехмерных структур каналов появляется медленнее из-за трудностей в кристаллизации мембранных белков для рентгеноструктурного анализа. Однако молекулярная информация, получаемая от сиквенс-анализа, и структурная информация относительно нескольких канальных белков выявила много важных тем, которые мы обсудим в конце этой главы.

Таблица 6-2. Основные семейства белков ионных каналов человека