Диагностики наследственных
болезней

История применения биохимических методов диагностики
наследственных болезней насчитывает около 100 лет, первая половина этого пути отмечена лишь единичными примерами диагностики
отдельных болезней с использованием качественных биохимических
исследований мочи. Их применение началось с диагностики алкаптонурии в начале XX в., что позволило А. Гарроду открыть наследственные болезни обмена веществ, обусловленные блоком ферментативной
реакции. В 30-х годах была открыта простая реакция мочи с хлоридом
железа (зеленая окраска) при фенилкетонурии.

Молекулярно-генетические методы диагностики наследственных болезней
стали внедрять в практику с 70-х годов XX в., и до настоящего времени они остаются бурно развивающейся областью науки и медицины. Молекулярно-генетические методы обязаны своим развитием Кери Мюллису — изобретателю полимеразной цепной реакции (1986),
которая лежит в основе всех широко используемых в клинической диагностике
молекулярно-генетических тестов. ПЦР — метод амплификации ДНК in vitro. За
несколько часов можно размножить определенную последовательность ДНК в
количестве, превышающем исходное в миллион раз и более, что позволяет работать с минимальным объемом исходного материала (вплоть до одной клетки).
Амплифицированную ДНК затем анализируют с помощью различных методов.

Развиваясь в качестве самостоятельной группы методов, молекулярно-генетическая диагностика обогатила и дополнила классическую цитогенетику.

Биохимические методы. Биохимические методы направлены на определение биохимического фенотипа 
организма. Уровни, на которых оценивают фенотип, могут быть разными - от
первичного продукта гена (полипептидной цепи) до конечных метаболитов 
в крови, моче или поте.

Хроматографические методы анализа играют важнейшую роль в диагностике наследственных болезней обмена (НБО). Для количественного
анализа маркеров-метаболитов НБО успешно применяют такие хроматографические методы, как газовая и высокоэффективная жидкостная хроматография
(ВЭЖХ), а также хромато-масс-спектрометрия. Газовая хроматография и
ВЭЖХ — универсальные методы разделения сложных смесей соединений, отличающиеся высокой чувствительностью и воспроизводимостью, в обоих случаях
разделение осуществляют в результате различного взаимодействия компонентов
смеси с неподвижной и подвижной фазами хроматографической колонки.

Для
 газовой хроматографии подвижной фазой служит газ-носитель, для ВЭЖХ — жидкость (элюент). Выход каждого соединения фиксирует детектор прибора, сигнал
которого преобразуется в пики на хроматограмме. Каждый пик характеризуется
временем удерживания и площадью. Следует отметить, что газовую хроматографию проводят, как правило, при высокотемпературном режиме, поэтому ограничением для ее применения считают термическую неустойчивость соединений. Для
ВЭЖХ не существует подобных ограничений, так как в этом случае анализ проводят в мягких условиях.

Масс-спектрометрия — аналитический метод, с помощью которого можно
получать как качественную (структура), так и количественную (молекулярная
масса или концентрация) информацию об анализируемых молекулах после их преобразования в ионы. Существенное отличие масс-спектрометрии от других физико-химических аналитических методов состоит в том, что в масс-спектрометре
определяют непосредственно массу молекул и их фрагментов. Результаты представляют графически (так называемый масс-спектр).

Иногда невозможно анализировать сложные многокомпонентные смеси молекул без их предварительного разделения. Это можно сделать либо хроматографически (жидкостная или газовая
хроматография), либо использовать два последовательно соединенных масс-
спектрометра (тандемная масс-спектрометрия — ТМС). ТМС позволяет охарактеризовать структуру, молекулярную массу и провести количественную оценку
3000 соединений одновременно, при этом для проведения анализа длительная
подготовка проб не требуется (как, например, для газовой хроматографии), а время
исследования занимает несколько секунд.

Материалом для биохимической диагностики могут быть моча, пот, плазма и сыворотка крови, форменные элементы крови, культуры клеток (фибробласты, лимфоциты) и биоптаты
мышц. При использовании просеивающего метода в биохимической диагностике
можно выделить два уровня: первичный и уточняющий. Основная цель первичной диагностики заключается в том, чтобы обнаружить
здоровых людей и отобрать пациентов для последующего уточнения диагноза.
 Показания для применения биохимических методов диагностики у новорожденных: нарушения сознания, судороги, нарушения ритма дыхания, мышечная
гипотония, нарушения вскармливания, желтуха, специфический запах мочи и
пота, метаболический ацидоз с дефицитом оснований и гипогликемия. У детей
более старшего возраста биохимические методы используют во всех случаях
подозрения на НБО (задержка физического и умственного развития, потеря приобретенных функций, увеличение размеров внутренних органов), а также при
клинической картине, специфичной для определенного заболевания.

Молекулярно-генетические методы. Многие формы наследственных
нарушений можно быстро и надежно диагностировать с помощью молекулярногенетических методов. Их диагностические возможности позволяют не только
уточнить диагноз и различить гено- и фенокопии, но и разобраться в других сложных случаях, проводить пресимптоматическую, пренатальную и неонатальную
диагностику, организовывать программы просеивающей диагностики, а также
определять носительство у родственников больных и оказывать помощь при планировании семьи.

Дефекты ДНК отражены во всех ядросодержащих клетках организма, поэтому
в большинстве случаев для анализа можно взять любую ткань или биологическую
жидкость. Чаще всего в качестве образцов используют цельную кровь или пятна
высохшей крови, слюну, буккальный соскоб, мочу, амниоциты или ворсинки
хориона.

Виды молекулярно-генетической диагностики 


1. Диагностическое тестирование, которое проводят у пациентов с признаками заболевания.

2. Пренатальная и предимплантационная диагностика предусматривает либо забор плодного материала (хорионбиопсия,
амниоцентез, кордоцентез), либо отбор эмбрионов при проведении экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). В первом случае инвазивная процедура сама по себе несет риск осложнения
течения беременности. Молекулярные
методы позволяют обнаруживать хромосомные перестройки и мозаичность плода при содержании мутантных клеток не менее 15-20%.

При проведении ЭКО из бластоцисты для анализа забирают одну клетку, что
значительно усложняет проведение тестирования и требует применения высокочувствительных методов, основанных на ПЦР. Подобные манипуляции безусловно повышают шансы на рождение
здорового ребенка в случае успешной подсадки и вынашивания эмбриона.

3. Определение носительства обычно применяют в семье, в которой у кого-либо из родственников уже обнаружено заболевание и установлена связанная с ним мутация.
Таким образом, речь идет об определении аутосомно-рецессивных мутаций в
гетерозиготном состоянии у здоровых людей. Результаты тестирования важны при
планировании деторождения и позволяют подготовить супругов к инвазивной пренатальной диагностике.

4. Предсказательное тестирование сложно наследуемых заболеваний - одно из самых новых и активно развиваемых направлений медицинской
генетики. Современные методы позволяют оценивать риск наследственной предрасположенности ряда сердечно-сосудистых, психических заболеваний, опухолей, нарушения репродукции и др.

С этической точки зрения возникает ряд непростых вопросов. Здоровый
человек получает удручающую информацию о его здоровье, которое еще только
может испортиться в будущем. Ее открытие может повлечь за собой поражение в
правах при страховании и поиске работы и вызвать трудности при создании семьи.
По этим причинам широкое внедрение предсказательного тестирования поддерживают не все профессиональные генетики. Тем не менее, в настоящее время как
в России, так и за рубежом доступны отдельные тесты и специально подобранные
 панели полиморфизмов генов, определение которых позволяет уточнить предрасположенность к различным заболеваниям, а значит и дает возможность заниматься их целенаправленной профилактикой. При опухолях возможен прогноз эффективности разных видов лечения.

5. Ф армакогенетическое тестирование - определение полиморфизмов, существенно влияющих на чувствительность
индивидуумов к лекарственным препаратам.