Классический подход к расшифровке последовательностей ДНК

Самый распространенный на сегодняшний день способ секвенирования ДНК — «метод терминации цепи», или «дидезокси метод», разработанный в 70-х гг. прошлого века Фредериком Сэнгером (дважды лауреат Нобелевской премии по химии: за определение аминокислотной последовательности инсулина (1955 г.) и за разработку метода секвенирования ДНК (1980 г.)). Дешевизна, точность, а также сравнительная простота автоматизации делает этот метод своеобразным «золотым стандартом» среди всех существующих способов определения последовательности нуклеотидных остатков ДНК. Так был расшифрован весь геном человека, и именно метод Сэнгера до сих пор является рутинным в повседневной лабораторной практике.

Вначале фрагменты ДНК, последовательность которых предстоит определить, многократно копируются (амплифицируются), затем нарезаются на короткие куски, которые служат матрицей для синтеза комплементарных цепей ДНК. Синтез в общих чертах напоминает процесс копирования ДНК в живой клетке.

Вначале фрагменты ДНК, последовательность которых предстоит определить, многократно копируются (амплифицируются), затем нарезаются на короткие куски, которые служат матрицей для синтеза комплементарных цепей ДНК. Синтез в общих чертах напоминает процесс копирования ДНК в живой клетке.

Особенность метода заключается в использовании химически модифицированных разновидностей четырех дезоксирибонуклеотидов, составляющих цепи ДНК. Каждая разновидность «помечена» флуоресцентной молекулой-маркером, на жаргоне «краской». Короткий фрагмент ДНК, называемый затравкой, или праймером, инициирует синтез ДНК в определённой точке цепи ДНК-матрицы. Синтезирует комплементарную цепь особый фермент — ДНК-полимераза. При этом флуоресцентно меченные разновидности нуклеотидов, которые присутствуют в реакционной смеси в значительно меньших количествах, чем обычные нуклеотиды, обрывают синтез, когда один из них оказывается на конце растущей ДНК-цепи. (Все дело в том, что видоизмененные нуклеотиды не имеют той самой химической группы, к которой должен присоединяться следующий нуклеотид для продолжения цепи.) В результате получается смесь, содержащая полный набор ново-синтезированных фрагментов ДНК, каждый из которых начинается в одном и том же месте, но заканчивается во всех возможных положениях вдоль цепи ДНК-матрицы.

Современные автоматизированные секвенаторы разделяют эти фрагменты, пропуская всю смесь через тончайшие капилляры, наполненные гелем. Чем короче фрагмент, тем быстрее он движется в геле по капилляру под действием электрического поля. (Фрагменты ДНК — по сути, ионы, движущиеся в электрическом поле от «минуса» к «плюсу».) Процесс, называемый капиллярным электрофорезом, настолько эффективен, что фрагмент, только что вышедший из капилляра, оказывается ровно на один нуклеотид длиннее, чем предшествующий ему. По мере того как фрагмент появляется, он освещается лазером, что заставляет светиться меченый нуклеотид на его конце. Компьютер определяет разновидность этих нуклеотидов по цвету вспышки и регистрирует последовательность их появления, складывая «буквы» (нуклеотиды) в «текст» (последовательность ДНК). В случае расшифровки целого генома так нарабатываются миллиарды коротких «текстов», которые поступают в специальную программу, запускаемую на суперкомпьютерах. Программа находит места перекрывания «текстов» и, располагая их в нужном порядке, выстраивает полную последовательность генома.

Большинство новых технологических разработок направлено на миниатюризацию, мультиплексирование (в данном случае, параллельное соединение низкопроизводительных блоков системы для повышения общей производительности) и автоматизацию процесса секвенирования. Все они могут быть разделены на два класса. Первый объединяет методы «секвенирования синтезом», в которых основания определяются по мере того, как они встраиваются в растущую цепь ДНК.

Ко второму классу относятся технологии расшифровки последовательности оснований единичной молекулы ДНК. Некоторые из них достаточно экзотичны — как, например, чтение нуклеотидных остатков ДНК электронным или оптическим способом по мере того, как молекула «протискивается» через нанопору. Длинный перечень улучшений системы капиллярного электрофореза в сочетании с возрастающей автоматизацией и усовершенствованием программного обеспечения позволили снизить стоимость секвенирования в 13 раз с тех пор, как первые автоматические секвенаторы появились в 90-е годы.

Но все это выглядит несколько бледно на фоне возможностей нового метода секвенирования синтезом — изощрённого варианта пиросеквенирования, разрабатываемого и внедряемого компанией 454 Life Sciences.