Физико-химические свойства ДНК

Молекулярная масса ДНК определяется рядом методов, в том числе:
а) Ультрацентрифугированием в градиенте CsCl (ММ от 200000 до 10⁹);
б) по вязкости растворов (ММ> 10⁹, поскольку при центрифугировании такие длинные молекулы разрываются под действием собственного веса).

ДЕНАТУРАЦИЯ ДНК заключается в разрыве Н-связей и стэкинг-взаимодействий, что приводит к расплетанию и разделению цепей. (БЕЗ РАЗРЫВА КОВАЛЕНТНЫХ СВЯЗЕЙ!) под действием температуры или рН.

О степени денатурации судят по изменению интенсивности поглощения в ультрафиолете при l= 260 nm, поскольку дезэкранирование азотистых оснований в результате расплетания цепей устраняется, что вызывает увеличение степени поглощения раствором ДНК ультрафиолета указанной длины волны:

Денатурацию иначе называют ПЛАВЛЕНИЕМ, а температура плавления соответствует моменту 50%-ной денатурации молекулы. Т плав. разная для каждой ДНК.

Комплементарные цепи ДНК, разделенные при денатурации, при определенных условиях могут вновь соединиться в двойную спираль. Этот процесс называется ренатурацией. Если денатурация произошла не полностью и хотя бы несколько оснований не утратили взаимодействия водородными связями, ренатурация протекает очень быстро. Ренатурация возможна даже при полностью разделенных цепях. В таком случае ренатурация требует точного совмещения цепей ДНК, которое может привести к реассоциации, и этот процесс медленный, к тому же, зависит от концентрации цепей в растворе. Как правило, выдерживание раствора ДНК при температуре на 10-15 С ниже температуры плавления в условиях средней ионной силы (0,15 М) обеспечивает наиболее благоприятные условия для ренатурации. При более низкой ионной силе ренатурации мешает взаимное отталкивание фосфатных групп. Реассоциация начинается со взаимодействия коротких комплементарных последовательностей нуклеотидов, время существования которых в ассоциированном состоянии может оказаться непродолжительным, если соседние участки ДНК окажутся некомплементарными. Процесс повторяется снова и снова, пока не ассоциируют "нужные" участки. Однако, как они провзаимодействуют, двойная спираль ДНК восстанавливается очень быстро. Ренатурация- двухстадийный процесс. На первом этапе должны встретиться два комплементарных участка. Вероятность такой встречи описывается уравнением второго порядка, когда взаимодействуют ДВЕ цепи:
dt/dc = -kC²,
где k- константа скорости реакции ассоциации.
Интегрирование этого уравнения дает:
C/C₀ = 1/(1 + kC₀t),
где С- концентрация однонитевой ДНК в момент времени t, выраженная в молях на литр (моль/л). C₀- концентрация ДНК в момент времени 0. Построение зависимости C/C₀ (которая пропорциональна концентрации однонитевой ДНК) против значения C₀t дает рисунок, показанный ниже:

Доля реассоциированной ДНК равна 1- C/C₀. Определение значения C₀t, соответствующего C/C₀=0,5 (или 1-C/C₀), позволяет вычислить значение C₀t_0,5. Эта величина пропорциональна сложности генома. СЛОЖНОСТЬ генома, в свою очередь, численно равна его молекулярной массе (под термином "молекулярная масса" в случае ДНК чаще всего понимается число пар оснований, которые она содержит), при условии, что этот геном единственный и имеет УНИКАЛЬНУЮ последовательность. Например, сложность и молекулярная масса генома, состоящего всего из трех ни разу не повторяющихся уникальных последовательностей нуклеотидов могут быть выражены суммой нуклеотидных пар последовательностей: N₁ + N₂ + N₃. В этом случае сложность и молекулярная масса генома совпадают. Однако, геномы эукариот, содержащие как уникальные, так и повторяющиеся последовательности, имеют различные сложность и молекулярную массу. При этом сложность их намного меньше молекулярной массы. Например, если геном содержит 100000 копий последовательности N₃, 1000 копий последовательности N₂ и одну уникальную последовательность N₁, его сложность будет выражена суммой пар оснований последовательностей N₁ + N₂ + N₃, а молекулярная масса- суммой пар оснований 100000 N₃ + 1000 N₂ + N₁.

Суммарная "длина" генома сложноорганизованного человека и, например, лосося или комара, могут быть соизмеримы, однако, сложность генома человека намного выше. В геноме того же лосося, например, существует огромное число повторений одинаковых последовательностей нуклеотидов, вызванные физиологическими особенностями, средой обитания и т.д. Совершенно бессмысленно сравнение уровня развития организмов по числу хромосом или количеству генов (последовательностей нуклеотидов) в геноме, которые могут состоять из различного числа пар нуклеотидов.

C₀t- кривые геномов эукариот с повторяющимися фрагментами содержат несколько кинетических компонент. Наиболее часто повторяющиеся последовательности реассоциируют быстрее всего:

Этот идеализированный график представляет ДНК, состоящую из трех определенных компонентов последовательностей с тремя различными значениями C₀t. Их процентное соотношение можно прочитать на оси ординат (1-С/Со). Частота повторения и сложность генома вычислены по принципам, описанным выше:

Зависимости для реальной молекулы ДНК совсем не так однозначны и легко читаемы, как на показанном гипотетическом примере.