Работа № 4. Определение активности альфа-амилазы в сыворотке крови и моче

Принцип метода. Альфа-амилаза катализирует гидролиз нерастворимого цветного крахмального субстрата с образованием синего растворимого в воде красителя. Количество освобожденного красителя пропорционально активности фермента.

Ход определения. Для определения активности альфа-амилазы в сыворотке крови или моче готовят параллельно опытную и контрольную пробы и анализируют в следующей последовательности:

Компоненты	Пробы крови, мл	Пробы мочи, мл
	опытная	контрольная	опытная	контрольная
Суспензия субстрата
	Инкубация в течение 5 мин. при + 37°С
Сыворотка крови	0,10	-	-	-
Моча	-	-	0,05	-
Дистиллированная вода	-	0,10	-	0,05
	Инкубация в течение 15 мин. при 37°С
Осаждающий раствор
Активность амилазы		Норма: 130-150 Е/л		Норма: 1,00-2,00 Е/мл

Пробы перемешивают, оставляют стоять на 15 мин, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Затем измеряют оптическую плотность опытной пробы против контрольной на ФЭКе при длине волны 590 нм в кюветах с толщиной слоя 5,0 мм.

Активность фермента находят по калибровочному графику.

Клинико-диагностическое значение определения активности альфа-амилазы в сыворотке крови и моче: у человека альфа-амилаза секретируется поджелудочной и слюнными железами, небольшая ее активность обнаруживается в ткани печени и скелетной мускулатуры. Молекулярная масса фермента относительно низка (»48000), поэтому он фильтруется в клубочках почек и содержится в моче.

У здоровых людей в сыворотке активность фермента от 140 до 350 Е/л, в моче - от 1000 до 2000 Е/л. Активность амилазы увеличивается, главным образом, при заболеваниях поджелудочной железы (при остром панкреатите). К повышению активности альфа-амилазы сыворотки крови приводят заболевания слюнных желез, хронические заболевания почек.

Работа № 5. Влияние адреналина на содержание глюкозы в крови.

Ход работы. У кролика из краевой вены уха или у крысы из хвостовой вены набирают 0,1 мл крови и определяют о-толуидиновым методом содержание глюкозы в крови.

Затем у животного выстригают на боку шерсть, протирают кожу спиртом и водят подкожно 0,1 % раствор адреналина из расчета 0,1 мл на 1 кг веса и через 30 минут повторно определяют содержание глюкозы в крови.

Работа № 6. Влияние инсулина на содержание глюкозы в крови.

Ход работы. У другого кролика из краевой вены уха или у крысы из хвостовой вены взять 0,1 мл крови и определить содержание глюкозы в крови.

У животного выстричь шерсть на боку, обработать спиртом и ввести подкожно инсулин из расчета 1,5 международных единиц на кг веса. Через час повторно определить содержание глюкозы в крови. Ввести животному подкожно 5% раствор глюкозы для предотвращения инсулинового шока: кролику 10 мл, крысе - 1 мл.

Результаты 3-й и 4-й работ внести в таблицу и сделать выводы.

Гормон	Глюкоза крови до опыта	Количество введенного гормона	Глюкоза крови в конце опыта
Адреналин
Инсулин

Выводы:

Задание по УИРС:

Каждая рабочая группа студентов определяет активность амилазы мочи у одного из товарищей и заносит результаты анализа в специальную анкету обследования по УИРС. Одна группа студентов изучает влияние инсулина, а другая - влияние адреналина на сахар крови в эксперименте на животных. В конце занятия каждая группа студентов докладывает группе свои результаты и выводы.