Главная Случайная страница Контакты | Мы поможем в написании вашей работы! | ||
|
Цель занятия: ознакомление с ионообменным методом ВЭЖХ определения количественного содержания и состава углеводов в медах с использованием метода внешнего стандарта или абсолютной калибровки
Сущность метода.
Сущность метода заключается в извлечении углеводов из навески меда водой и определении их состава и количественного содержания на жидкостном хроматографе с рефрактометрическим детектором методом ионообменного элюирования с использованием калибровочного графика стандартов.
Материалы и оборудование.
1. Хроматограф жидкостной с насосом Waters 1525 EF и рефрактометрическим детектором Waters 2414 с диапазоном измерения по коэффициенту рефракции 1-1,75 RIU
2. Колонка хроматографическая стальная Sugar –Pak, размером 6.5×300 мм, наполненная микрокристаллическим катионообменным гелем в кальциевой форме.
3. Установка ультразвуковая с частотой ультразвука 43-45 кГц.
4. Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределами абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0,1 мг.
5. Фильтры с размером пор 0,45 мкм, диаметром 13 мм.
6. Элюент 0,0001 М раствор кальция ЭДТА (кальциевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты), приготовленный на воде с удельным сопротивлением 2 мега Ом*см.
7. Глюкоза кристаллическая гидратная, х.ч. по Гост 975-88.
8. Фруктоза кристаллическая, х.ч.имп.
9. Вода деионизованная с удельным сопротивлением 2 мега Ом*см.
Построение градуировочных графиков для стандартов глюкозы и фруктозы.
(1,0 + 0,0005) г стандартного образца препарата глюкозы растворяют в деионизованной воде в колбе вместимостью 100 мл, доводят этим же растворителем до метки и перемешивают. Получают основной стандартный раствор глюкозы с содержанием 10 мг/мл.
Из этого раствора готовят градуировочные (рабочие) растворы, содержащие 1 мг; 5 мг; 10мг; 15мг; 20 мг глюкозы в 100 мл соответственно. Для этого берут соответственно 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 мл основного раствора, помещают в мерные колбы вместимостью 100 мл, доводят до метки деионизованной водой и перемешивают.
Аналогичным образом готовят рабочие стандартные растворы для препарата фруктозы.
Растворы пригодны в день приготовления.
Рабочие стандартные растворы анализируют на жидкостном хроматографе при следующих условиях:
– хроматографическая колонка стальная Sugar–Pak, размером 6,5×300 мм, наполненная микрокристаллическим катионообменным гелем в кальциевой форме;
– подвижная фаза 0,0001 М раствор кальция ЭДТА (кальциевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты), приготовленный на воде с удельным сопротивлением 2 мега Ом*см;
– объем пробы 20 мкл;
– скорость подачи элюента 0,5 мл/мин;
– температура хроматографической колонки 80°С;
– температура детектора 50°С;
Время выхода хроматографического пика глюкозы составляет 9,5 мин, фруктозы 11,4 мин.
Каждый раствор хроматографируют по 2 раза и строят калибровочные графики для глюкозы и фруктозы соответственно, откладывая по оси ординат значения площадей хроматографических пиков, по оси абсцисс – значения содержания глюкозы или фруктозы в мг в 100 мл раствора.
Проверка градуировочных графиков.
Градуировочные графики контролируют не реже 1 раза в неделю. Для этого 1-2 рабочих раствора стандартов глюкозы и фруктозы хроматографируют при выше указанных условиях. Отклонения полученных результатов (площадь хроматографических пиков) от измеренных в момент построения градуировочного графика, А %, определяют по формуле (1)
(1) |
где, S1 и S2 –площади хроматографических пиков, определенные при построении градуировочного графика и в момент проверки соответственно.
При отклонении результатов более, чем на 5 %, строят новый градуировочный график по свежеприготовленным растворам препарата глюкозы и фруктозы.
Проведение анализа
Навеску меда массой 1 г, взвешенную с погрешностью не более 0,0005 г, помещают в стаканчик вместимостью 100 мл, приливают 50 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Затем раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят этим же растворителем до метки и перемешивают.
1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки деионизованной водой и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм и используют для хроматографирования.
Подготовку проб проводят в двух параллелях.
Хроматографирование
Полученные испытуемые растворы хроматографируют по 2 раза. На хроматограммах испытуемых растворов находят площади хроматографических пиков сахаров глюкозы и фруктозы, рассчитывают среднее значение площадей и по градуировочномым графикам определяют содержание соответствующих сахаров в 100 мл в мг.
Хроматографирование испытуемых растворов осуществляют в тех же условиях, что и стандартные растворы, при построении калибровочных графиков.
Обработка результатов испытания.
Содержание сахаров глюкозы (Х1) и фруктозы (Х2) в испытуемых образцах в мг/г определяют по формуле (2):
; | (2) |
Где, С1 (С2) –содержание сахаров глюкозы и фруктозы в 100 мл, найденное по калибровочным графикам, в мг соответственно,;
m- масса навески меда, г;
100- разведение
Результат определения вычисляют с точностью до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемое расхождение между которыми при доверительной вероятности Р=0,95 не должно быть более 10 % относительно среднего арифметического значения.
Список рекомендуемой литературы
1. ФСП 42-0119-0445 00 Пиридоксин раствор для инъекций 50 мг/мл.
2. ГОСТ Р 53773-2010 Продукция соковая. Методы определения антоцианинов.
3. Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище Р 4.1.1672-03.
4. Методика копании Waters по разделению моносахаров методом ионообменной хроматографии с помощью колонки Waters Sugar-Pak I.
5. Гост Р 50929-96 Приемиксы. Методы определения витаминов группы В.
6. Нолтинг Б. Новейшие методы исследования биосистем. Мир биологии и медицины. Перевод с анг. Хромова-Борисова Н.Н.. М. Техносфера. 2005г.– 254 с.
7. Стыскин Е.Л., Ициксон Е.Б., Брауде Е.Б. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография, М., 1988 г–284 с.
8. Уильсон К., Уолкер Дж. Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии. Пер. с англ. –М; Бином. Лаборатория знаний, 2013.–848 с.: ил., [4] с. цв. Вкл. – (Методы в биологии).
Дата публикования: 2015-06-12; Прочитано: 395 | Нарушение авторского права страницы | Мы поможем в написании вашей работы!