Билет 10

Химический состав бактериальной клетки практически не отличается от животных и растительных клеток высших организмов. В состав бактерий входят в основном те же органические и минеральные вещества. Различия выявляются в количественном содержании тех или иных соединений. Отличия в широком наборе ферментов у бактерий.
Вода составляет основную часть тела бактериальной клетки -на нее приходится от 75 до 90% массы клетки. Содержание воды в микробной клетке может меняться в зависимости от вида микроба, возраста культуры, состава питательной среды. В спорах содержание воды снижается до 40%.
Сухой остаток составляет от 10 до 25% массы бактериальной клетки. Основная часть его (около 95%) представлена макромо-лекулярными соединениями. В состав сухого остатка входят также низкомолекулярные органические соединения и неорганические вещества, чаще в виде солей. Основной материал сухого остатка составляют азот, кислород, углерод и водород. Содержание этих элементов может колебаться довольно значительно. Так, содержание углерода у микробов составляет 40 - 55% сухого вещества, кислорода - 30 - 40%, азота - 6 - 15%, водорода - 6 - 8%. Однако у разных представителей микроорганизмов эти соотношения могут варьировать. Также в сухой остаток входят белки, жиры, углеводы, минеральные в-ва, нуклеиновые к-ты рнк и днк для передачи ген. Инф-ции. Особенности метаболизма:Метаболизм (обмен веществ) бактерий представляет собой совокупность двух взаимосвязанных противоположных процессов катаболизма и анаболизма. Катаболизм (диссимиляция) - распад веществ в процессе ферментативных реакций и накопление выделяемой при этом энергии в молекулах АТФ. Анаболизм (ассимиляция) - синтез веществ с затратой энергии.Особенности метаболизма у бактерий состоят в том, что:- его интенсивность имеет достаточно высокий уровень, что возможно обусловлено гораздо большим соотношением поверхности к единице массы, чем у многоклеточных;
- процессы диссимиляции преобладают над процессами ассимиляции;- субстратный спектр потребляемых бактериями веществ очень широк - от углекислого газа, азота, нитритов, нитратов до органических соединений, включая антропогенные вещества - загрязнители окружающей среды (обеспечивая тем самым процессы ее самоочищения);- бактерии имеют очень широкий набор различных ферментов - это также способствует высокой интенсивности метаболических процессов и широте субстратного спектра.

ЗАДАЧА:сальмонелла I этап 1.Выделение гемокультуры:

1. Кровь засевают в соотношении 1:10 во флаконы со средой Раппопорт, или 10-20% желчным бульоном, или в стерильную дистиллированную (водопроводную) воду. Посевы помещают термостат при 37⁰С на 10 суток. 2.Через 24 часа делают высев из сред обогащения на ВСА (Эндо, Левина, Плоскирева) → 37⁰С 48 часов. Примечание: Если результат первого высева будет отрицательным, через 2 суток делают второй высев на ВСА. При отрицательном результате третий высев можно делать на 5-7-ой или 10-й день. 2.Выделение копрокультуры: 1. Испражнения засевают на пластинчатые среды Эндо, Левина, Плоскирева с антибиотиком и без, СПА, которые инкубируют при 37⁰С 24 часа, и на ВСА → 37⁰С 48 часов. 2. Материал засевают на одну из сред накопления: селенитовый бульон, или бульон Мюллера, или бульон Кауфмана, или магниевую среду. При посеве на среду обогащения кусочек испражнений эмульгируют в 10мл среды. Посев инкубируют при 37⁰С 14-16 часов. 3. Выделение уринокультуры 1. 5мл мочи вносят в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 5 мин при скорости 3 000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают в дезинфицирующий раствор, осадок засевают. II этап 1. Отобрать на чашке Петри с ВСА изолированную типичную для сальмонелл колонию, т.е. обведите её стеклографом со стороны дна чашки. 2. Часть колонии (½) пересейте на одну из сред первичной идентификации энтеробактерий: Клиглера, или Ресселя, или Олькеницкого для первичной идентификации культуры. Посев инкубируют при 37⁰С 24 часа. 3. Оставшуюся часть этой же колонии пересейте на скошенный СПА с целью выделения и накопления чистой культуры и её последующей серологической идентификации → 37⁰С 24 часа. Тесты миним. Дифф. Ряда: Проводят первичную идентификацию культуры (определяют её родовую принадлежность) по характеру роста на среде Клиглера (Ресселя). Проверяют однородность выделенной чистой культуры, т.е. делают мазок со скошенного СПА, окрашивают по Граму, микроскопируют, должны быть клетки однородные. Делают посев чистой культуры на среды Гисса и СПБ с двумя индикаторными бумажками (на индол и сероводород) → 37^оС 24 час. Посев на среду Симмонса → 37^оС 24 час.- Посев в столбик полужидкогоагара → 37^оС 24 час. Проба на оксидазу.

Билет11 Иммуноглобулины и антитела – синонимыПродуцентами иммуноглобулинов являются плазматические клетки. Ig разных классов отличаются друг от друга биологическими свойствами. IgG – составляют около 80% сывороточных Ig (в среднем 12г/л), с молекулярной массой 160 000Д они образуются на высоте первичного иммунного ответа и при повторном введении Аг (вторичный ответ). IgG являются единственным классом антител, проникающих через плаценту в организм плода Они термостабильны.. IgM – первыми начинают синтезироваться в организме плода и первыми появляются в сыворотке крови после иммунизации людей большинством Аг. Они составляют около 13% сывороточных Ig при средней концентрации 1г/л. По молекулярной массе они значительно превосходят все другие классы Ig–900 000Д. Они термостабильны. Период полураспада5суток. IgA – встречаются в сыворотке крови и в секретах на поверхности слизистых оболочек. Молекулярная масса 170 000 – 350 000 дальтон, термостабилен. Период полураспада 6 суток. СывороточныйIgA синтезируется в плазмоцитах селезенки, лимфоузлов и слизистых оболочек. СекреторныеIgA отличаются от сывороточных наличием секреторного компонента, который синтезируется клетками секреторного эпителия и может функционировать в качестве их рецептора, а к IgA присоединяется при прохождении последнего через эпителиальные клетки. СекреторныеIgA играют существенную роль в местном иммунитете. Около 40% общего IgA содержится в крови. IgD – до 75% IgD содержится в крови, достигая концентрации 0,03 г/л. Он имеет молекулярную массу 180 000 ДТермолабилен. Период полураспада 3 суток IgE – в норме содержатся в крови в концентрации 0,00025 г/л. Молекулярная масса 190 000 Д, период полураспада 2 суток термолабильны, не проходят через плаценту. IgE синтезируются плазматическими клетками в бронхиальных и перитониальных лимфатических узлах, в слизистой оболочке желудочно- кишечного тракта Антитела (иммуноглобулины,Ig) –это специфические белки крови, образующиеся в ответ на введение антигена и способные специфически реагировать с ним. Структура антитела. Белки Ig по химическому составу относятся к гликопротеидам, т. к. состоят из протеина и сахаров; построены из 18 аминокислот. Молекулярная масса Ig находится в пределах от 150 – 900 кД. Молекулы Ig имеют цилиндрическую форму, видны в электронном микроскопе. До 80% Ig имеют константу седиментации 7S; устойчивы к слабым кислотам, щелочам, нагревания до 60^оС. Выделить Ig из сыворотки крови можно физическими и химическими методами (электрофорез, изоэлектрическое осаждение спиртом и кислотами, высаливание, аффинная хроматография и др.). Эти методы используют в производстве при приготовлении иммунобиологических препаратов. Функции антител:Первичная функция Ат состоит взаимодействии их активных центров комплементарными (гомологичными, соответствующими) им детерминантами Аг. Вторичная функция Ат состоит в способности их:а) связывать Аг с целью его нейтрализации и элиминации из организма, т. е. принимать участие в формировании защиты от Аг; б) участвовать в распознавании «чужого» Аг; в) обеспечивать кооперацию иммунокомпетентных клеток (макрофагов, Т- и В -лимфоцитов); г) участвовать в различных формах иммунного ответа (фагоцитозе, киллерной функции, ГНТ, ГЗТ, иммунологической толерантности, иммунологической памяти)

ЗАДАЧА:иерсинии I этап 1.Посев испражнений на 6 чашек Петри (как при выделении E.coli) ® 22°С 24-48 часов.2.Фагодиагностика с чумным и псевдотуберкулезным диагностическими фагами. 2 этап 1.Отбирают по культуральным свойствам типичную для иерсиний изолированную колонию и ½ часть ее пересевают на одну из сред первичной идентификации энтеробактерий:Клиглера, или Ресселя, или Олькеницкого® 22°С 24 часа.2.Оставшуюся часть этой же колонии пересевают на скошенный СПА® 22°С 24 часа. III этап 1.Проверяют однородность выделенной чистой культуры, т. е. делают мазок и окрашивают по Граму, микроскопируют.2.Проводят первичную идентификацию выделенной культуры по характеру ее роста на среде Клиглера (или Ресселя, или Олькеницкого).3.Проба на оксидазу (-).4.Посев на короткий «пестрый» ряд Гисса и СПБ с 2 индикаторными бумажками на индол и сероводород® 22°С 24 часа.5.Посев в 2 столбика полужидкого агара, один посев инкубируют при22°С 24 часа (подвижны), а другой – при 37°С 24 часа (неподвижны). 6.Посев на среду Симмонса® 22°С 24 часа (не утилизируют цитрат все три вида иерсиний). 7.Посев на среду с мочевиной® 22°С 24 часа (+). 8.РА с чистой культурой и чумной агглютинирующей сывороткой (-). 9.Фаголизабельность: с чистой культурой повторяют пробу с диагностическими фагами – чумным и псевдотуберкулезным. 10.Проба на чувствительность к антибиотикам - посев на среду АГВ® 22°С 24 часа. IV этап 1.Учет результатов всех тестов. 2.Выдача окончательного ответа: «Выделена Y. enterocolitica ………». В качестве вспомогательного метода применяют серодиагностику. Ставят РНГА с сывороткой крови обследуемого

БИЛЕТ12 Морфология спирохет. представляют собой спирально извитые подвижные микроорганизмы, объединённые в порядок Spirochaetales, семейство Spirochoutaceae, включающее 3 рода: Borrelia, Treponema, Zeptospira. Первых они напоминают отсутствием компактного ядра. Со вторыми их сближает фибриллярность структуры цитоплазмы, наличие трипластоподобного образования, напоминающего оболочку клеток животных организмов. Спирохеты имеют форму длинных тонких спирально извитых клеток, длиной от 5 до 500 мм, шириной 0,2-0,75 мкм. В структурном отношении клетка спирохеты представляет собой цитоплазматический цилиндр, ограниченный ЦПМ и покрытый клеточной стенкой. У клетки имеется двигательный фибриллярный аппарат, в цитоплазме содержится нуклеоид, рибосомы, лизосомы и включения. Фибриллы — ошалош жгутиков бактерий, состоят из белка флагеллина. Их количество и величина неодинаковы у разных видов. Количество фибрилл в пучке у каждой клетки от 4 до 10 и более. Спор и капсул не образуют. Форма, количество завитков и характер движения у спирохет различны и являются поэтому важными дифференциальными признаками, позволяющими определить принадлежность к роду.. Морфологию спирохет изучают в световом микроскопе в окрашенных препаратах по методу Романовского - Гимзы: сапрофиты окрашиваются в синий цвет, бледная трепонема и лептоспиры - в розовый (бледно розовыйО, а боррелии - в сине-фиолетовый.Морфологию спирохет изучают в живом состоянии, путём микроскопии препаратов «висячая» или «раздавленная» капля в тёмном поле зрения МОРФОЛОГИЯ РИККЕТСИЙ. Риккетсии занимают промежуточное положение между бактериями и вирусами. Представляют собой грам- прокариоты, мелкие, размеры не превышают 1,5 мкм. Как правило, они не способны расти на искусственных питательных средах, т.е. являются облигатными паразитами Отличаются выраженным полиморфизмом, образуя кокковидные, палочковидные, нитевидные формы. Располагаться могут одиночно, по двое, или в виде коротких цепочек. Электронно-микроскопические исследования показали, что риккетсии не имеют жгутиков, не образуют спор и капсул. МОРФОЛОГИЯ ХЛАМИДИИ. Хламидии или гальпровии относятся к облигатным внутриклеточным кокковиднымграм- бактериям. Хламидии размножаются только в живых клетках: их рассматривают как энергетических паразитов. Хламидии, подобно риккетсиям, обладают свойством особым образом воспринимать окраску; Эта способность меняется на разных стадиях развития. Одиночные зрелые частицы («элементарные тельца») по Романовскому-Гимзе окрашиваются в пурпурный цвет, который хорошо контрастирует с синим цветом цитоплазмы клеток хозяина. Крупные неинфекционные тельца (первоначальные тельца) окрашиваются по Романовскому - Гимзе в синий цвет. Окраска по Граму даёт отрицательные или вариабельные результаты, поэтому данный метод не имеет ценности при идентификации возбудителей. У человека хламидии вызывают трахому, орнитоз и др. Размножаются они как и бактерии путём поперечного деления. Новобразованные мелкие частицы могут выходить из клетки хозяина и инфицировать новые клетки. Цикл развития занимает 24-48 часов. МОРФОЛОГИЯ МИКОПЛАЗМ. Микоплазмы имеют строение прокариотов, но у них отсутствует клеточная стенка. Это - мелкие бактерии, окружённые цитоплазматической мембраной. Этим объясняется их полиморфизм. Из-за отсутствия клеточной стенки микоплазмы осмотически чувствительны и имеют разнообразную форму: кокковидную, нитевидную, колбовидную, гранул в виде крошечных кокков и элементарных телец, крупных шаров, колец, палочек, ветвящиеся или мицелиапьные формы и др.Размеры микоплазм варьируют от 125-250нм у гранулярных форм до 0,4-150мкм у нитевидных структур. Жгутиков, капсул, спор не образуют. По Граму окрашиваются отрицательно. МОРФОЛОГИЯ АКТИНОМИЦЕТ. Актиномицеты - это ветвящиеся грам+ бактерии. Клетки актиномицет имеют те же структурные элементы, что и бактерии: клеточную стенку, ЦПМ, нуклеоид, рибосомы, мезосомы, внутриклеточные включения. Некоторые актиномицеты образуют микрокапсулу; жгутиков не имеют, истинных спор не образуют.На концах некоторых актиномицетов образуются одна или несколько экзоспор, которые являются органами плодоношения.Спороносцы актиномицетов прямые, волнистые и спиральные; споры крупные овальные и цилиндрические с гладкой волосистой, бородавчатой или шиловидной поверхностью МОРФОЛОГИЯ ГРИБОВ. Форма клеток у молодых культур может быть круглая, яйцевидная или удлинённая; у зрелых клеток - грушевидная, булавовидная, веретенообразная, амёбовидная. По строению грибы сходны с водорослями: они обладают дифференцированным ядром (одним или несколькими), клеточной стенкой, ЦПМ. Цитоплазма у молодых культур гомогенная, у зрелых - зернистая; в ней находятся митохондрии, аппарат Гольджи, вакуоли, различные включения (гликоген, волютин, липиды, пигменты, кристаллы органических солей). Основным структурным компонентом клеток грибов является мицелий, состоящий из разветвлённых бесцветных нитей (гиф) 1-10 мкм в диаметре и 4 - 70 мкм длиной. ЗАДАЧА: холерный вибрион. Нет нельзя. I этап 1. Материал в объеме 0,5-1,0 мл засевают пипеткой в 50-100 мл накопительной среды (1% пептонная вода) и инкубируют 37^оС 6-8 час. 2. Материал засевают петлей на щелочной агар (ЩА) и инкубируют при 37^оС не менее 14-16 час, а также на одну из элективных сред (ЭС) или TCBS. 3. С материалом проводят ускоренные методы диагностики: иммунолюминесцентный; реакцию иммобилизации холерных вибрионов специфической холерной О-сывороткой; полимеразную цепную реакцию со специфическимипраймерами. II этап (через 6-8 час от начала исследования) 1. С первой среды накопления делают высев на ЩА и одну из ЭС и в 5-8 мл второй среды накопления. Пересевы в жидкие и на плотные среды делают с поверхности жидкой среды большой бактериологической петлей диаметром 5 мм. Режимыинкубациипосевовкакна 1 этапе. 2. При отрицательных результатах исследования нативного материала ускоренными методами их повторяют после 6 час инкубации первой среды накопления (с пленкой) III этап (через 12-16 час от начала исследования) 1. Высев со второй среды накопления на ЩА и инкубируют при 37^оС 14-16 час. В случае необходимости ускорения хода анализа материала от больного или подозрительного на заболевание холерой, отбор колоний со ЩА, засеянного в начале исследования, можно начинать уже на этом этапе, в остальных случаях – на следующем. IV этап (через 18-24 час от начала исследования) 1. Отбор подозрительных на холерный вибрион колоний в посевах на плотные среды нативного материала, а также в высевах из 1-ой и 2-ой накопительных сред. Чашки с посевами просматривают в проходящем свете невооруженным глазом или с помощью лупы, также под стереоскопическим микроскопом в косо проходящем свете и отбирают подозрительные на вибрионы колонии для выделения и идентификации культуры. 2. Подозрительные колонии проверяют в слайд-агглютинации с сывороткой холерной 01 в разведении 1:50 – 1:100. При положительной реакции ставят слайд агглютинацию с сыворотками Инаба и Огава в том же разведении. 3. Приготавливают мазки для окраски по Граму и обработки флюоресцирующими иммуноглобулинами. 4. При отрицательных результатах колонии, обнаруженные в посевах материала от больных, проверяют в слайд-агглютинации с холерными сыворотками 0139 и RО. V этап (через 24-36 час от начала исследования) 1. Отбирают культуры на ПУС, принадлежащие к роду Vibrio (по изменению цвета столбика при сохранении цвета скошенной части без образования газа не образующие сероводород и образующие индол); 2. Культуры, выросшие на ЩА, проверяют на наличие индофенолоксидазы. 3. Определяют морфологию микроорганизмов и чистоту отобранных культур, выросших на ЩА и ПУС, с помощью окрашенных по Граму мазков, проверяют подвижность в препарате «раздавленная» капля. VI этап (через 36-48 час от начала исследования) Учитывают результаты идентификации и выдают окончательный ответ о выделении культуры холерного вибриона соответствующей серогруппы и биовара

БИЛЕТ13. Понятие о дезинфекции. Дезинфекция (обеззараживание) – совокупность способов полного, частичного или селективного (выборочного) уничтожения патогенных микроорганизмов на объектах окружающей среды, и факторах их передачи с целью профилактики инфекционных заболеваний. Основных группах дезинфицирующих веществ и механизме их действия. Наиболеешироко применяют следующие группы. Альдегиды – глутаральдегид, янтарный альдегид, формальдегид и другие являются веществами с выраженными антимикробными свойствами, включающими активность в отношении всех видов микроорганизмов за счет алкилирования амино- и сульфгидрильных групп протеинов и подавления синтеза последних. Антимикробная активность формальдегида несколько ниже таковой глутаральдегида. Кроме того, считается, что пары формальдегида могут вызывать канцерогенный эффект. Комбинация формальдегида с 70% этиловым или изопропиловым спиртом является дезинфектантом высокого уровня. Водный раствор формальдегида обладает свойствами дезинфектанта среднего уровня. Кислородсодержащие препараты, в частности перекись водорода, являются сильными окислителями, основой действия которых является образование свободных радикалов, повреждающих липиды клеточной мембраны, ДНК и другие важные компоненты микробной клетки. Несмотря на продукцию многими микроорганизмами каталазы, которая защищает клетки от воздействия перекиси водорода путем разложения ее на воду и кислород, используемые при дезинфекции концентрации Н2О2 позволяют в большинстве случаев преодолеть данный механизм резистентности. Однако в высоких ее концентрациях на фоне таких положительных качеств, как широкий спектр активности, включающий споры бактерий, способность растворять кровь и многие другие биологические вещества, отсутствие запаха, быстрое разложение во внешней среде на нетоксичные продукты, выражены отрицательные качества – высокая тканевая токсичность (II класс) с выраженным местнораздражающим и резорбтивным действием. Перекись водорода вызывает коррозию некоторых металлов и обесцвечивает ткани. Хлорактивные соединения (хлорная известь, хлорамин) – традиционные средства дезинфекции. Механизм уничтожения микроорганизмов свободным хлором окончательно не выяснен. К числу вероятных путей воздействия хлора относят подавление некоторых важнейших ферментных реакций в микробной клетке, денатурацию белков и нуклеиновых кислот. Традиционные хлорсодержащие препараты обладают высокой антимикробной активностью, но имеют резкий запах, раздражающий слизистые оболочки глаз и верхних дыхательных путей, вызывают коррозию металлов, обесцвечивают окрашенные изделия, имеют низкую стабильность при хранении, инактивируются органическими веществами и не обладают моющими свойствами. Современные хлорсодержащие препараты – производные циануровых кислот – как правило, имеют либо композиционный состав, либо модернизированную форму выпуска, что позволяет значительно нивелировать их отрицательные качества. Из соединений йода наиболее широко для дезинфекции используют йодофоры – комплекс йода с носителем, например с поливинилпирролидоном или этоксилированными неионными детергентами, который представляет собой резервуар постоянно высвобождающегося молекулярного йода.

ЗАДАЧА:

КАМПИЛОБАКТЕР Спор и капсул не образуют. Подвижны, совершают характерное быстрое винтовое движение с помощью одиночных жгутиков, расположенных на одном или обоих концах клетки. Микроскопическое исследование тонкого мазка, окрашенного 1% раствором фуксина в течение 10-30сек., позволяет быстро обнаружить спиралевидные или S-образные бактерии. Типичные формы чаще обнаруживают при окраске кристаллическим фиолетовым. Также можно применять фазово-контрастную микроскопию суспензии испражнений в жидкой среде (нативные препараты). Основным методом является бактериологическое исследование – выделение чистой культуры возбудителя и ее идентификация. Кампилобактеры плохо переносят транспортировку - их следует помещать в консервант, например, тиогликолевый бульон (рН 8,5) или щелочную пептонную воду, и хранить при температуре 4⁰С. Материал засевают на элективные питательные среды (например, среду Бутлера). Серодиагностика. Для идентификации Аг бактерий применяют РА с обработанной формалином культурой (через 10 суток после инфицирования титр Ат составляет 1:8 – 1:32) или РСК (видоспецифическая реакция, требующая соответствующего Аг).В России разработаны диагностикумы для выделения Ат в реакции РНГА, применяемые для распознавания кампилобактериозов животных и человека.За рубежом разработаны коммерческие реагенты для выявления Ат в РИФ или реакции иммунной сорбции Ат, меченных ферментами (ИФА), иммунный блотинг,