Мутагенное влияние химических факторов на систему крови

В механизме действия химических факторов принято выделять общеток­сическое и мутагенное действие. Общетоксическое действие, очевидно, прояв­ляется в пределах модификационной изменчивости. Мутагенный эффект хими­ческого воздействия, в вышеприведенной аналогии, связан с мутационной из­менчивостью организма, которая в условиях совпадения рецессивных признаков при оплодотворении, может привести к наследственным изменениям. Однако, любое химическое влияние независимо от общетоксического или мутагенного эффекта, реализуется при участии генети­ческого аппарата. Поэтому, вероятно следует полагать, что химические вещест­ва с мутагенным эффектом обусловливают значительное усиление частоты му­тации, когда создается предпосылка большей вероятности передачи по наслед­ству нежелательных негативных признаков.

В процессе изучения мутагенного действия негативных факторов среды широко применяется микроядерный тест. При этом допускается зависимость между тинкториальными особенностями микронуклеол и степенью мутагенного эффекта. Так, в крупных микронуклеолах предполагался более значительный деструктивный процесс в хромосомах в ус­ловиях значительного мутагенного воздействия. И, наоборот, наличие мелких микронуклеол оценивается как признак менее значительного мутагенного эффекта.

Если обратиться к более ранней литературе, то легко обнаружить описа­ние ядерных остатков в эритроцитах. Обобщая изме­нения в эритроцитах, связанных с сохранением остатков распада ядра, приводятся различные варианты:

1. Красная политохроматофилия, красная пунктуация и красная штриховатость эритроцитов. При окраске по Романовскому-Гимза (в модификации Паппенгейма) в эритроцитах можно наблюдать азурофильную полихромазию и пунктуацию. В этом случае, благодаря избирательной окраске азуром-2, эрит­роцит или целиком окрашен в красно-фиолетовый цвет (красная полихромазия), или в нем обнаруживается красно-фиолетовая пунктуация в виде отдель­ных зерен или глыбок. Автор допускает, что азурофильная окраска при полихромазии возникает в процессе хромолиза, а азурофильная пунктуация и штриховатость Негелли (красноватые пятнышки и штрихи) при кариорексисе;

2. Хроматинные пылинки Вайденрайха, тельца Говелл-Жолли и кольца Кебота в эритроцитах. Хромативные пылинки Вайденрайха – это наиболее тонкая азурофильная грануляция. Тельца Говелл-Жолли – несколько более крупные хромативные глыбки. Кольца Кебота – азурофильные тонкие кольца в виде цифры «8» или сложных петель.

Нет сомнений, что вышеприведенные структуры эритроцитов имели ядерное происхождение, так как они поглощали ядерные краски и, соответст­венно, окрашивались в красно-пурпурный (азуром-2, гематоксилином) или зеленый (метилгрюн-пиронином) цвета и связаны с деструкцией хроматина. Красная полихроматофилия, безусловно, является результатом кариолизиса аналогично цитолизису лейкоцитов (тельца Боткина-Гумпрехта), однако, дру­гие виды остаточных хроматиновых структур вполне можно расценивать как микронуклеолы. Действительно, тельца Говелл-Жоли относят к микроядрам.

При дифференцированном анализе структурно-тинкториальных свойств остатков распада ядра нормоцитов (полихроматофильных и оксифильных) об­наруживается не только перечисленные автором разновидности, а много разных промежуточных состояний. Однако, для одновременного со­блюдения преемственности, на наш взгляд, можно успешно их использовать для оценки глубины мутагенного эффекта. Аналогично тромбоцитарной и ретикулоцитарной формулам, целесооб­разно микронуклеограмму оценивать на основе дифференцированного подхода к тинкториальным свойствам, одновременно применяя давно известные в лите­ратуре представления о ядерных остатках в эритроцитах. В настоящее время микроядерный тест используется для определения му­тагенности агентов различной природы.

Остатки ядерного материала в эритроцитах были описаны Жолли (1907), поэтому в литературе микроядра именуются тельцами Говелл-Жоли. Учитывая, что эритроциты в костном мозге на­ходятся на разных стадиях созревания, некоторые ученые анализируют микро­ядра только в полихроматофильных эритроцитах. Полихроматофильные эритроциты дифференциру­ются из полихроматофильных нормоцитов – последних клеток в эритроидном ряду, способных к митозу. Его ядро вскоре становится пикнотичным и обычно выталкивается. Оставшиеся хромосомы и фрагменты хромосом – микроядра остаются в клетках. При этом нормохромные эритроциты проходят более длительный путь развития. Предполагается, что этим и обу­славливается различие в частоте клеток с микроядрами при раздельном анализе полихроматофильных и нормофильных эритроцитов в костном мозге живот­ных, подвергнутых воздействию мутагенов.

Многие исследователи провели изучение уровня эритроцитов с микрояд­рами в периферической крови, установив соответствие наблюдае­мых в крови и костном мозге изменений. Анализ состава периферической крови позволяет, не умерщвляя живот­ных, изучать воздействие на организм мутагенных факторов. В то же время вы­явлено селективное действие против микроядер в эритроцитах. Указано, что выход эритроцитов в кровоток происходит через поры эндотелиальных клеток. При этом ядро и, возможно, микроядра задерживаются и вследствие этого эритроцит выходит в кровоток уже без ядерного материала. Микроядерный анализ можно проводить не только на безъядерных эрит­роцитах, но и в эмбриональных эритроцитах, в спермато­зоидах, что особенно важно при прогнозе возможных послед­ствий для потомства. Кроме того, изучен уровень микроядер при воздействии мутагенов на гепатоцитах, энтероцитах, спленоцитах и в лейкоцитах крови.

Объектами для микроядерного анализа служили не только мыши, но и самые разнообразные представители животного мира: крысы, собаки, мангусты, рыбы, морские ежи, обезьяны. Много исследований проведено на растениях: на корешках конских бобов и мейотических клетках традесканции. Следует указать на целесообразность применения микроядерного теста при обследовании различных контингентов населения на предмет выявления производственных, бытовых и других мутагенных вредностей, а также для скрининга наследственно обусловленной нестабильности генома.

Ряд авторов представили методические разработки, в которых подробно описано взятие крови или костного мозга, приготовление мазков, их фиксация и окраска. Установлено, что микроядра не имеют полной ядерной оболочки и в них отсутствует периферический конденсированный хроматин. Количество пор не зависит от размеров микроядер. Как правило, микроядра локализированы в одной клетке и отличаются по размерам в зависимости от содержания в них ДНК. При этом ДНК способна к репликации, а время репликации в различных микроядрах не совпадает. По размерам микроядер можно судить об изменениях произошедших в хромосомах. Образование крупных микроядер (диаметр 2–3 мкм) тесно связано с геномными нарушениями, в то время как уровень клеток с мелкими микрояд­рами связывают с частотой разрушений в структуре хромосом. При этом клетки с ацен­трическими фрагментами представляют предшественников клеток с микрояд­рами. Следует отметить, что не всегда присутствовала подобная закономер­ность. Установлено, что частота эритроцитов с микро­ядрами никогда не зависела от уровня к-митозов, многогрупповых мега-анафаз и анафаз с местами. При этом уровень клеток с патологией «деление – отстава­ние» отдельных хромосом в мега – и анафазе, свидетельствовал в пользу выво­да о том, что крупные микроядра образованы отставшими хромосомами, а мел­кие – в основном структурами хромосом. Показана корреляционная связь между уровнем клеток с микроядрами и частотой спермиев с морфологическими аномалиями. Увеличе­ние числа клеток с микроядрами сопровождалось снижением митотического индекса, слипанием и отставанием хромосом и хроматидными разрывами.

При высоких концентрациях мутагена нарушается линейный характер числа микроядер в зависимости от дозы мутагена. Токсиче­ские дозы могут приводить к ингибированию деления клеток с микроядрами. Приведены факты, свидетельст­вующие о том, что часть микроядер образуется путём отделения хроматина ин­терфазного ядра и авторы полагают, что это результат деструкции клетки. В связи с этим следует отметить, что в некоторых случаях корреляция между час­тотой микроядер и митотическим индексом очень низка, но имеется четкая зависимость числа клеток с микроядрами от дозы мутагена. Несоответст­вие приведенных данных возможно обусловлено природой мутагена или объек­том исследования. Так, уровень клеток с микроядрами больше у старых животных, что, по-видимому, отражает связанную с возрастом сниженную способ­ность к репарации. В клетках имею­щих микроядра, отмечается изменение антигенной структуры оболочки, что инициирует цитологическую реакцию лимфоцитов-киллеров, устраняющих ци­тологически абберантные клетки.

С помощью микроядерного теста изучена мутагенная чувствительность особей разного пола. Анализ костного мозга мышей показал, что этилметансульфат вызы­вает значительно большие нарушения у самок, чем у самцов. Различия в уровне клеток с микроядрами у самцов и самок при воздействии мутагенов, по-видимому, обусловлены гормонами, так как авторами не было выявлено отли­чий в мутагенной чувствительности между самками и кастрированными самца­ми. Показано, что стресс влияет на результат микроядерного анализа, кото­рый сопровождается выбросом в кровь гормонов. У неполовозрелых трёхнедельных мышей не обнаружено существенных различий на уровне микроядер между самцами и самками. Однако в другом исследова­нии было показано, что различия в уровне клеток с микроядра­ми зависят в первую очередь не от пола, а от вида мутагенного фактора исполь­зуемого в эксперименте. Установлено, что агенты, вызывающие увеличение уровня микроядер, индуцировали аберрацию хромосом, увеличение уровня сестринских хроматидных обликов и изменения в числе хромосом, а также генные мутации у салмонелл, кишечной палочки и дрозофилы.

В то же время имеются данные, свидетельствующие о том, что с помо­щью микроядерного теста не всегда можно объективно оценить мутагенность различных веществ. Так, в 1981 году различными исследователями, согласно программы ИКЕМ Английского общества по испытанию мутагенов окружаю­щей среды, проведена оценка мутагенности 4-хлор-метилбифенила (4ХМБ), 4-гидроксиметилбифенила и бензилхлорида. Микроядерным тестом в самых его разнообразных модификациях не было выявлено мутагенности этих веществ. Однако другими тестами было показано, что 4ХМБ является мощным му­тагеном прямого действия с широким спектром мутации для сальмонелл, нейроспоры и культуры клеток человека. Тем не менее, следует отметить, что мутагенность 4ХМБ не выявлена не только в микроядерном, но и некоторыми другими тестами на мышах: в тесте на морфологию головки спермиев, сегрегацию соматических клеток. Имеются указания на то, что на индукцию микроядер влияет способ введения мутагена. Так, некоторые мутагены индуцируют высокий уровень микроядер при внутрибрюшинном и значительно в меньшей при пероральном, а также при накожном и ингаляционном способах введения. Определено время появления микроядер и эффективность их индукции при воздействии на мышей различных по действию мутагенов. Наибольшее число клеток с микроядрами наблюдалось через 24–30 часов после однократного мутагенного воздействия. Однако отмечается, что для достоверной оценки мутагенности препарата в микроядерном тесте лучше многократное, чем однократное введение мутагена. Быстро распадающиеся веще­ства не способны индуцировать повышение уровня микроядер. Кроме того, по­казано, что количество клеток с микроядрами зачастую зависит не от дозы, а от природы мутагена.

Одной из важных проблем генетической токсикологии и профилактиче­ской онкологии является ускорение и повышение надежности выявления по­тенциальных канцерогенов. Основной путь решения этой проблемы – испыта­ние веществ в краткосрочных тестах на млекопитающих и оценка эффекта их воздействия на разные органы. Удобным тестом для этого является количественный анализ клеток с микроядрами. В основном он проводится на полихроматофильных эритроцитах костного мозга и реже – на клетках других органов. Зависимость степени мутагенной активности от дозы и времени действия по микроядерному тесту установлена во многих работах: при изучении хлорамфеникола, бензола, никель содержащей пыли. Микроядерный тест использовался на животных при изучении влияния мутагенов внешней среды. Применение микроядерного теста для экологического мониторинга оправдано высокой его чувствительно­стью к мутагенам различной природы. Метод достаточно прост, не требует больших затрат расходных материалов и вследствие этого, имеется возмож­ность провести обследование большой выборки исследуемых.

Микроядерный тест применим для расчета интегративного «показателя повреждаемости» цитогенетического аппарата клеток крови организма, что по­зволяет провести оценку мутагенного влияния среды обитания человека. В связи с возрастающей антропогенной нагрузкой на окружающую среду обитания, оценка и обеспечение генетической безопасно­сти населения являются одним из важнейших направлений медико-биологических исследований. Во многих работах показано, что действие не­благоприятных факторов окружающей среды может привести к накоплению мутагенного «груза» в человеческой популяции и вызвать различный спектр генетических заболеваний. Учитывая, что вопросы экологического мониторинга последствий за­грязнения окружающей среды достаточно разработаны и применяются в практических исследованиях, оценку мутагенной нагрузки можно провести, применяя микроядерный тест в эритроцитах периферической крови человека.